LAMP在臨床微生物檢測中的應用及進展

郭 綺 綜述，楊甦慶 審校

(1.重慶市藥品技術審評認證中心，重慶 401120；2.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗中心，重慶 401147)

環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)的關鍵是鏈置換型合成酶、引物及終點檢測方法[1]。與一般的DNA聚合酶不同，鏈置換型合成酶能催化引物以雙鏈DNA的一條鏈為模板延伸，合成一條與之互補的鏈，替換另一條鏈。為保證核酸擴增的特異度與靈敏度，LAMP的引物至少需設計4條，用于識別DNA模板的6個不同區(qū)域。在產(chǎn)物檢測方法方面，LAMP主要通過監(jiān)測顏色變化評價反應。近20年來，研究者們開發(fā)出了引物設計軟件，發(fā)現(xiàn)了新型鏈置換型合成酶,優(yōu)化了產(chǎn)物檢測方法,還設計出了多重LAMP及逆轉(zhuǎn)錄LAMP，每一次技術的突破，均推動了LAMP在臨床微生物檢測領域的應用。

1 LAMP技術原理及檢測方法發(fā)展

1.1LAMP擴增原理 LAMP反應開始后內(nèi)引物上游引物(FIP，由F2和F1c組成)的F2區(qū)與靶DNA的F2c區(qū)雜交，在鏈置換DNA聚合酶(Bst)聚合酶作用下，合成1條FIP連接的與靶DNA互補的DNA單鏈，然后外引物F3與靶DNA的F3c區(qū)雜交并延伸，取代FIP連接的互補鏈。互補DNA單鏈被置換脫離后F1c和F1區(qū)互補配對形成莖環(huán)，然后作為內(nèi)引物下游引物(BIP，由B2和B1c組成)的模板。BIP的B2區(qū)與模板DNA的B1c區(qū)雜交，合成1條BIP連接的與模板DNA互補的DNA單鏈，并打開模板DNA 的莖環(huán)結(jié)構。隨后B3與模板DNA B3c區(qū)域雜交并延伸，取代BIP連接的互補鏈。此BIP連接的互補鏈脫落，分別在兩端形成莖環(huán)，得到一個啞鈴狀的DNA鏈，其過程見圖1。這種結(jié)構作為LAMP擴增循環(huán)階段的模板，最終得到的產(chǎn)物是具有不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構、不同長度DNA的混合物(靶DNA的交替反向重復序列)。

圖1 LAMP啞鈴狀模板構造的形成過程

1.2LAMP的終點檢測方法 LAMP應用在臨床微生物檢測中的一大優(yōu)勢是結(jié)果觀察方便、簡單。LAMP在臨床微生物檢測中用的終點檢測方法有濁度法、瓊脂糖凝膠電泳法、顯色法及橫向流動試紙條法(LFD)、對擴增產(chǎn)物進行探針分析等，各方法具備相應的優(yōu)缺點，在選取檢測方法時要根據(jù)實際情況考量。

1.2.1瓊脂糖凝膠電泳法 瓊脂糖凝膠電泳是LAMP設計初期采用的方法。因為檢測過程中需打開反應管，易導致氣溶膠溢出，增加攜帶污染的風險，且瓊脂糖凝膠制備過程中用到的熒光染色劑——溴化乙錠是一種對人體有致癌作用的高危險化學物質(zhì)，因此，其應用受到一定的限制。

1.2.2顯色法 用于LAMP顯色的染色劑有鈣黃綠素、羥基萘酚藍(HNB)、熒光染料(SYBR Green Ⅰ)等。SYBR Green Ⅰ在恒溫孵育前加入，抑制反應，在恒溫孵育后加入易引起氣溶膠污染[2]。HNB染料可在恒溫孵育前加入，但HNB不能發(fā)射熒光，僅能用肉眼觀察顏色變化。鈣黃綠素是最常用的LAMP染色劑，已被用于克氏錐蟲、丙型肝炎病毒、人乳頭瘤病毒、人冠狀病毒[3-4]等病原微生物的檢測。其不僅可在恒溫孵育前加入，且結(jié)果通過紫外線、自然光均能觀察到[5-6]。

1.2.3濁度法 濁度法可對反應產(chǎn)物進行定性和定量檢測，原理為反應產(chǎn)生的副產(chǎn)物與反應溶液中的Mg2+反應，生成白色沉淀，既可通過目視法檢查渾濁，也可通過在特定波長下監(jiān)測沉淀的生成定量檢測擴增產(chǎn)物。目前，市面有實時檢測LAMP反應的濁度儀，如LA-200、LA-320和LA-500。采用濁度法檢測的臨床微生物有肺炎支原體、人乳頭瘤病毒及艱難梭菌等[7-8]。

1.2.4LFD LFD由于成本低、使用方便、簡單、快速、輕便等優(yōu)點而成為目前最受青睞的技術之一。只需將待測樣本滴加于結(jié)合有LAMP緩沖液和生物素的試紙條一端(樣品墊)就能進行檢測。其原理為利用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的DNA探針與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物雜交后[9]與膠體金標記的抗FITC抗體結(jié)合形成復合物，被橫向流動試紙條上具有生物素抗體的檢測線捕獲并顯示結(jié)果[10]。

1.2.5對擴增產(chǎn)物進行探針分析 納米金作為光學探針及電化學傳感器正廣泛用于DNA檢測領域[11]。DRAZ等[12]應用納米金探針對腸炎沙門菌擴增產(chǎn)物進行標記，然后用萊卡顯微鏡采集表面增強拉曼光譜進行分析。結(jié)果顯示，該方法的靈敏度(66 CFU/mL)比傳統(tǒng)的PCR法提高了100倍，具有較高的特異性，可將其與密切相關的細菌或非特異性污染的DNA區(qū)分開來。

2 LAMP在臨床微生物檢測中應用及進展

2.1LAMP在細菌檢測中的應用及進展 LAMP被成功用于檢測人體感染的細菌，如結(jié)核分枝桿菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌等，且不斷有新的細菌反應體系的構建。某些用傳統(tǒng)方法檢測有困難的細菌，在建立了特異性LAMP反應體系后可成功檢測并快速得到結(jié)果。肺炎鏈球菌的傳統(tǒng)診斷方式為染色鏡檢，但在樣品采集和處理過程中肺炎鏈球菌的自溶酶系統(tǒng)易使其快速死亡，導致檢測難以進行。XIA等[13]建立了一個對肺炎鏈球菌進行實時診斷的LAMP反應體系，利用實時熒光檢測裝置，對肺炎鏈球菌ATCC49619的DNA進行檢測，結(jié)果顯示，該反應能在20 min擴增得到結(jié)果，熒光峰通常持續(xù)10 min，檢測限為300 pg/μL，且能有效區(qū)分肺炎鏈球菌和其他15株非肺炎鏈球菌。在拓寬檢測病原菌種類的基礎上，LAMP在檢測病原菌的技術方面也不斷地創(chuàng)新，多重LMAP的應用不僅縮短了病原菌檢測時間，且可區(qū)分2個甚至多個病原菌。沙門菌和副溶血性弧菌是人類最常感染的食物傳播病原體，如能對從疑似病例上采集的樣本同時進行這2個病原體的快速檢測，對判斷食源性感染疾病非常有意義。LIU等[14]建立了一種多重實時循環(huán)介導的等溫擴增LAMP(mLAMP)方法，該方法結(jié)合熔融曲線分析，允許在60 min內(nèi)根據(jù)不同的解鏈溫度(Tm)值對擴增產(chǎn)物進行檢測和鑒別。該研究共分析了19株已知的細菌，包括1株副溶血性弧菌參考株(ATCC 17802)和7株沙門菌屬。結(jié)果顯示，副溶血性弧菌的Tm值為83.8℃，7株沙門菌的Tm值為86.5～86.8 ℃，平均(86.61±0.11)℃，對非沙門菌和非副溶血性弧菌株未獲得Tm值，未發(fā)生擴增，表明mLAMP能特異性檢測和區(qū)分沙門菌和副溶血性弧菌。LAMP不僅可對細菌進行鑒別，還可解決細菌的分型問題，傳統(tǒng)血清學分型易受細菌表面抗原表達量的影響。另外，抗生素的不當使用，導致臨床標本中存在抗生素，能培養(yǎng)出的細菌量很少甚至沒有。LEE等[15]首次采用LAMP法進行腦膜炎血清群特異性鑒定試驗，對31例腦膜炎球菌陽性腦脊液標本進行檢測，結(jié)果顯示，PCR檢測的檢出限為每反應103～104個基因組拷貝，LAMP分析的檢出限為10～100個基因組拷貝，LAMP的靈敏度較PCR提高了約100倍。且在2 h內(nèi)對31例樣本中的29例成功分型，其中A、B、C、X、Y型各5株，W型6株。

2.2LAMP在病毒檢測中的應用及進展 病毒檢測最常用的方法是逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導的等溫擴增(RT-LAMP)，利用逆轉(zhuǎn)錄酶從RNA中獲得互補DNA，并通過DNA聚合酶進行進一步擴增。RT-LAMP將所有的引物和酶(Bst聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶)在恒溫下孵育，可一步完成檢測[16]，已用于檢測各種病毒，如登革熱病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒和寨卡(ZIKA )病毒等。LAU等[17]研發(fā)出一種快速檢測登革熱病毒2種血清型的單管一步法RT-LAMP檢測系統(tǒng)，該方法設計了針對登革熱病毒的每一種血清型的LAMP引物集，并將引物集及其他反應需要物質(zhì)加入到一個LAMP反應管中，加入樣本反應30 min后就能檢測出登革熱病毒。研究樣本為登革熱感染者血清，反應過程通過環(huán)介導實時濁度儀LA-320監(jiān)測。結(jié)果顯示，該方法的檢測限低至10個目的RNA拷貝，在189個樣本中檢出115個陽性樣本，檢出率較實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)高15%，且與樣本中登革熱病毒特別相似的蟲酶病毒無交叉反應。此種單管一步法PR-LAMP雖然不能區(qū)分登革熱病毒的血清型，但可迅速判斷登革熱病毒感染與否，具有臨床實用性。目前，RT-LAMP最成功的應用之一是診斷人類免疫缺陷病毒(HIV)逆轉(zhuǎn)錄病毒。HIV病毒載量的檢測受到規(guī)模、成本和復雜操作的限制，開發(fā)一個能使病毒載量更易獲得的技術非常迫切。DAMHORST等[18]利用微流控芯片和硅微芯片平臺，對經(jīng)最小處理的HIV全血樣品進行RT-LAMP，并在移動智能設備上進行熒光測量，結(jié)果顯示，RT-LAMP能檢測到微量全血樣品中的HIV量，且滿足低成本、便攜性和易用性的實際要求，具有用于檢測其他病毒的潛力，讓病毒載樣量的檢測可在患者家中及臨床實驗室中用手指血進行。新型OmniAmp DNA聚合酶(POL)的發(fā)現(xiàn)是RT-PCR的一次重要革新，其替代了DNA聚合酶(Bst)和逆轉(zhuǎn)錄酶，實現(xiàn)靶RNA的單酶檢測，讓RT-PCR在病毒方面的檢測前景更加廣闊[19]。與傳統(tǒng)DNA聚合酶(Bst)和逆轉(zhuǎn)錄酶比較，該酶受全血成分的抑制作用較小，對稀釋的低病毒血癥樣品的檢測速度更快，具有更高的耐熱性和較好的干燥條件，可延長常溫下的儲存時間，更適于側(cè)流裝置和凍干LAMP反應管的研制。其利用POL對6種RNA病毒進行了RT-LAMP檢測，在30 min內(nèi)擴增出了所有靶標，不需額外步驟，也不改變用于DNA靶標的反應設計。POL較傳統(tǒng)RT-LAMP聚合酶更具有優(yōu)勢，更適于惡劣環(huán)境下的病毒診斷，為LAMP的便攜化發(fā)展奠定了基礎。

2.3LAMP在寄生蟲檢測中的應用及進展 寄生蟲是世界主要的死亡原因之一。LAMP在寄生蟲檢測中的應用為寄生蟲臨床樣本的現(xiàn)場檢測和在寄生蟲感染早期的及時檢測提供了有效手段。ZHANG等[20]采用LAMP法對30例惡性瘧原蟲臨床標本進行了檢測，結(jié)果顯示，LAMP檢測陽性率可高達90%，檢測限低至每微升5個寄生蟲，且對間日瘧原蟲、約氏瘧原蟲和弓形蟲的基因組DNA的檢測結(jié)果呈陰性，具有較強的抗干擾能力。POOLE等[21]以RF4基因為目標，研制了一種高靈敏度的LAMP檢測方法，結(jié)果顯示，RF4特異度LAMP能在30 min內(nèi)檢測到1條微絲蚴(100 pg)。NZELU等[22]采用LAMP檢測了利什曼原蟲，對122份疑似臨床樣本進行了測試。結(jié)果顯示，LAMP能有效檢測到101個DNA拷貝，靈敏度至少是常規(guī)PCR的100倍。這對利什曼原蟲感染早期，其密度很低時的檢測是非常有意義的。有研究利用mLAMP與斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(dot-ELISA)相結(jié)合，進行豬肉絳蟲、牛肉絳蟲和亞洲帶絳蟲的鑒別，以細胞色素C氧化酶亞基1基因為靶標，分別采用FITC、地高辛(DIG)和四甲基羅丹明(TAMRA)標記FIP引物和生物素標記BIP引物進行單管mLAMP反應。每個物種的mLAMP產(chǎn)物通過dot-ELISA針對FITC、DIG或TAMRA的特異性抗體進行區(qū)分。如果用傳統(tǒng)的方法鑒別，一個樣品需3個反應混合物，既耗時又復雜，并增加了交叉污染的風險。mLAMP法與dot-ELISA相結(jié)合，可使人帶絳蟲的鑒定更加簡單、實用[23]。

3 LAMP的優(yōu)缺點分析

LAMP作為臨床微生物檢測手段具有快速、適合推廣、特異性強等優(yōu)點。LAMP最顯著的優(yōu)點是其快速性，由于LAMP不需傳統(tǒng)PCR中DNA模板的初始熱變性過程，所以，較傳統(tǒng)PCR減少了約2/3的反應時間，可實現(xiàn)立即診斷。LAMP的另一個優(yōu)點是推廣性強，與其他擴增反應比較，只需簡單水浴或金屬浴等提供恒溫條件，且結(jié)果評價可進行肉眼觀察。有研究者結(jié)合緩沖液中Bst DNA聚合酶的特點，研制出了一種用于LAMP的pH敏感染料。pH敏感染料根據(jù)LAMP擴增過程中pH從堿性到酸性的變化監(jiān)測LAMP反應，易于觀察，進一步提高了LAMP結(jié)果觀察的便利性[24]。LAMP的檢測特異性強，不受與靶DNA相似度高的非靶DNA及PCR抑制劑的影響，如血液的檢測可在不需要模板提取步驟和未經(jīng)處理樣本的情況下進行[25]。

盡管LAMP具有很多優(yōu)勢，但仍有一些限制因素阻礙其順利應用。由于LAMP擴增后得到的產(chǎn)物是1條大的DNA鏈，不適于除鑒定外的其他分子生物學目的，通用性較PCR低。為提高擴增靈敏度和特異性，引物的設計較復雜且受到限制。盡管目前已有免費的引物設計軟件，但為保證選擇到優(yōu)選目標位點，仍需人工參與引物設計。另外，多個引物的使用將增加引物之間的雜交概率，產(chǎn)生假陽性結(jié)果[26]。

LAMP的反應產(chǎn)物非常穩(wěn)定，不易降解[6]，易形成氣溶膠污染，且LAMP靈敏度高，即使極少量的陽性產(chǎn)物污染也會對結(jié)果產(chǎn)生影響，這就對操作過程提出了較高的要求[2]。

4 展 望

隨著造成感染性疾病的微生物種類日益復雜和耐藥菌甚至多重耐藥菌的劇增，微生物鑒定變得越來越困難，因此，需不斷更新診斷方法。在種類繁多的基因擴增技術中，LAMP以其快速、靈敏、特異度高等優(yōu)點促使研究人員不斷探索其在臨床微生物檢測中的應用。到目前為止，已開發(fā)了凍干形式的LAMP試劑和商業(yè)化用于微生物特異性檢測的LAMP試劑盒，但離便攜式LAMP產(chǎn)品的商業(yè)化還有一段距離。由于LAMP易于適應任何現(xiàn)場環(huán)境，且具有實時檢測所需的所有特性，相信隨著便攜式LAMP產(chǎn)品的進一步發(fā)展，LAMP在臨床微生物檢測領域的應用范圍會更加廣泛，為基層醫(yī)療及惡劣環(huán)境下的病原微生物檢測提供了有價值的工具。