膠體金免疫比色法測(cè)定血清h-FABP水平的初步研究

孫 宇,王 茹,顧李霖,李佳林,王會(huì)中

(解放軍第305醫(yī)院檢驗(yàn)科,北京 100017)

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)于1971年被美國(guó)學(xué)者OCKNER等[1]在腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種組織的FABP[2]。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)主要存在于心肌細(xì)胞質(zhì)中，心肌損傷時(shí)易于釋放入血。有研究表明，發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈綜合征(下稱“冠脈綜合征”)時(shí)，在未發(fā)生缺血、缺氧、壞死時(shí)即可檢出h-FABP[3-4]，目前，其已被推薦為冠脈綜合征的聯(lián)合測(cè)定指標(biāo)[5-6]。對(duì)h-FABP的檢測(cè)目前常用的有膠乳凝集比色法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法、金標(biāo)示蹤法等，國(guó)內(nèi)外均有相關(guān)成品試劑用于臨床，但這些方法存在價(jià)格昂貴、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且定量不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)[7]，不適宜基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)廣泛開(kāi)展。1980年LEUVERING等[8]利用免疫學(xué)反應(yīng)時(shí)金顆粒凝聚導(dǎo)致顏色減退的原理，建立了均相溶膠顆粒免疫測(cè)定法，成功用于人體絨膜促性腺激素(HCG)的檢測(cè)，開(kāi)啟了膠體金均相免疫檢測(cè)用于臨床檢測(cè)的開(kāi)端。程黎明等[9]于2010年報(bào)道了采用該技術(shù)用于胱抑素C的定量檢測(cè)。膠體金均相免疫反應(yīng)，分析靈敏度優(yōu)于普通均相免疫比濁試劑，且制作工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，原材料來(lái)源容易，基于這些優(yōu)勢(shì)，本研究建立了一種經(jīng)濟(jì)、便捷的h-FABP定量檢測(cè)方法，其基本原理是將抗h-FABP抗體用物理吸附方法連接到直徑約 80 nm的膠體金表面，此時(shí)在540 nm處有最大光譜吸收峰。當(dāng)吸附有h-FABP抗體的膠體金在液相中與h-FABP相遇時(shí)就會(huì)結(jié)合、聚集，在540 nm處吸光度值會(huì)降低，降低幅度與被結(jié)合h-FABP的量呈反比；同時(shí)，在 660 nm處會(huì)出現(xiàn)一個(gè)最大吸收峰，峰值與被結(jié)合的h-FABP量呈正比。通過(guò)檢測(cè)樣本溶液在540、660 nm處吸光度的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)溶液中h-FABP水平的測(cè)定，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源與采集 陽(yáng)性標(biāo)本取自2016年3-9月本院門診、住院經(jīng)確診為急性心肌梗死(AMI)患者52例。健康對(duì)照組標(biāo)本為本院健康體檢人員，無(wú)相關(guān)病史及體征，共50例。收集貝克曼檢測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果為臨界(Cut-off)值標(biāo)本30份，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與原料 氯金酸、蔗糖、甘氨酸溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉均為國(guó)藥化學(xué)試劑(分析純)，檸檬酸三鈉為Sigma (分析純)，脫脂奶粉為BD DifcoTM，吐溫-20為西隴化工產(chǎn)品(分析純)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)為Sigma(分析純)等。常規(guī)配制50 mmol/L、pH=7.2～7.4的對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBST)緩沖液；鼠抗人h-FABP多克隆抗體為北京博研生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(貨號(hào)604221C)；收集患者血清配制圍為60 ng/mL的h-FABP校準(zhǔn)血清備用。膠體金保存液：50 mmol/L Hepes，20%(w/v)蔗糖，1%(w/v)甘氨酸，1%(w/v)。

1.3主要檢測(cè)儀器與試劑 北京利德曼生化股份有限公司h-FABP檢測(cè)試劑及標(biāo)準(zhǔn)品、北京普析紫外可見(jiàn)分光光度儀TU1810型、日本日立S-4800電子顯微鏡等。所有試劑均在效期內(nèi)，嚴(yán)格按檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程要求進(jìn)行操作。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1膠體金制備 將10 mL 1%(w/v)氯金酸溶液與1 000 mL超純水在玻璃容器內(nèi)混合均勻，并加熱至沸騰。將10 mL 1%(w/v)檸檬酸三鈉溶液快速加入至容器內(nèi)，并保持加熱狀態(tài)。當(dāng)溶液由淡黃色變?yōu)榧t棕色，再變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)保持沸騰加熱20 min后停止加熱。待溶液冷卻至室溫后加超純水補(bǔ)足至1 000 mL，即制得實(shí)驗(yàn)所需膠體金顆粒。

1.4.2標(biāo)記物制備 取100 mL上述膠體金溶液，置于磁力攪拌器上(200 r/min)。緩慢滴加10% K2CO3溶液，將膠體金pH調(diào)至9.0～9.5，并保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)。將h-FABP抗體用50 mmol/L、pH 7.2 的PBST緩沖液稀釋至50～100 μg/mL，取一定量稀釋后的抗體緩慢滴加至膠體金溶液中，并保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)2 h。向膠體金溶液中加入1%(w/v)甘氨酸溶液1 mL和5%(w/v)脫脂奶粉溶液1 mL，保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，封閉1 h，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀用20 mL膠體金保存液復(fù)懸，磁力攪拌(300 r/min)2 h。

1.5反應(yīng)體系建立 將標(biāo)記h-FABP抗體按標(biāo)記物制備過(guò)程進(jìn)行梯度標(biāo)記，并用校準(zhǔn)血清進(jìn)行驗(yàn)證，確定最佳標(biāo)記量、樣本用量、反應(yīng)體積等。利用建立的反應(yīng)體系，自制標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)曲線用于定量檢測(cè)血清標(biāo)本。將校準(zhǔn)h-FABP抗原用抗原稀釋液倍比稀釋(空白、1/16、1/8、1/4、1/2、無(wú)稀釋分別為0、3.75、7.50、15、30、60 ng/mL)制得檢測(cè)膠體金標(biāo)記物校準(zhǔn)品。將標(biāo)準(zhǔn)物各稀釋濃度點(diǎn)分別取5、10、20、30、40 μL作為待檢樣本用量。以100 mL膠體金為標(biāo)記單位，參照標(biāo)記物制備步驟進(jìn)行小樣標(biāo)記物制備，h-FABP抗體標(biāo)記量為20、50、100、150、200 μg。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。確定最佳校準(zhǔn)品用量和最佳標(biāo)記梯度。

表1 反應(yīng)體系

1.6Cut-off值確定 以利德曼試劑檢測(cè)Cut-off值標(biāo)本30份為樣本，采用建立的反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)測(cè)定2次取均值，30份樣本均值再次取均值作為本檢測(cè)體系的Cut-off值。

1.7檢測(cè)性能初步驗(yàn)證 用制備的膠體金試劑檢測(cè)臨床樣本值并與利德曼公司檢測(cè)方法進(jìn)行比較，驗(yàn)證檢測(cè)體系的有效性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel2007軟件CORREL函數(shù)法計(jì)算對(duì)照試劑與該實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定值的相關(guān)系數(shù)(r)；比較膠乳凝集比色法與本實(shí)驗(yàn)方法陽(yáng)性標(biāo)本檢出的符合率。

2 結(jié) 果

2.1膠體金顆粒鑒定

2.1.1光譜掃描結(jié)果 將膠體金溶液用去離子水1∶3稀釋，用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)以去離子水調(diào)零，掃描膠體金溶液400～700 nm吸收峰，膠體金溶液在540 nm左右有最大吸收峰。見(jiàn)圖1。

2.1.2電鏡檢測(cè)結(jié)果 膠體金顆粒樣本經(jīng)電子顯微鏡檢測(cè)，平均顆粒大小(80.4±10.4)nm。見(jiàn)圖2。

圖1 膠體金光譜掃描圖

圖2 膠體金顆粒電鏡檢測(cè)結(jié)果

2.2標(biāo)記量確定 樣本用量與標(biāo)記量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。比較不同樣本的用量和標(biāo)記物用量間的關(guān)系，確定標(biāo)本用量為30 μL，h-FABP抗體選擇標(biāo)記量為100 μg/100 mL膠體金溶液。

圖3 30 μL標(biāo)本不同標(biāo)記量反應(yīng)校準(zhǔn)曲線

2.3陽(yáng)性判定值確定 對(duì)利德曼檢測(cè)試劑檢測(cè)處于Cut-off值的30份標(biāo)本采用本檢測(cè)體系進(jìn)行重復(fù)測(cè)定取平均值以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值。

表2 2種檢測(cè)體系檢測(cè)結(jié)果比較

2.4臨床樣本檢測(cè)比較 按確定的標(biāo)記量，分別采用利德曼檢測(cè)方法與本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體系檢測(cè)臨床樣本102例，對(duì)照試劑測(cè)值與膠體金標(biāo)記物呈正相關(guān)(r=0.962)，以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值，2種檢測(cè)體系檢測(cè)結(jié)果比較見(jiàn)表2。

3 討 論

隨著分析方法自動(dòng)化、配套試劑商品化，定量免疫分析技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，成為診斷疾病、評(píng)估療效的重要手段。對(duì)目前臨床常用的諸多檢測(cè)技術(shù)，大部分需特殊的檢測(cè)儀器與試劑，檢測(cè)成本高，增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用；但低成本的酶免疫分析與膠體金快速法又無(wú)法滿足準(zhǔn)確定量的需求。這些存在的問(wèn)題給基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)帶來(lái)了諸多的不便，迫切需要經(jīng)濟(jì)實(shí)用、便于開(kāi)展的檢測(cè)方法。且從經(jīng)濟(jì)發(fā)展和臨床需求看，免疫診斷技術(shù)的未來(lái)發(fā)展也是兩種趨勢(shì)，一是簡(jiǎn)單化、基層化，該方向適合免疫層析試紙條，如再輔以互聯(lián)網(wǎng)等信息平臺(tái)，易于實(shí)現(xiàn)個(gè)人化、家庭化，但受限于方法學(xué)很難精確定量；二是自動(dòng)化、定量化、低成本化，適合該發(fā)展方向的目前主要有膠乳增強(qiáng)免疫比濁、均相酶免疫和液相膠體金免疫等，隨著相關(guān)試劑性能的不斷改進(jìn)，很可能會(huì)影響發(fā)光免疫目前的主導(dǎo)地位[10]。

膠體金示蹤免疫層析技術(shù)廣泛用于臨床快速檢測(cè)中，其方法簡(jiǎn)便快捷，費(fèi)用低廉，但無(wú)法滿足規(guī)模化、高通量檢測(cè)要求，液相膠體金免疫比色技術(shù)的誕生解決了固相膠體金免疫技術(shù)的困擾[11-12]。

液相膠體金免疫比色技術(shù)基本原理是不同粒徑、不同顏色的膠體金顆?？膳c抗體等蛋白分子非共價(jià)結(jié)合，包被后的膠體金顆粒與待測(cè)樣本中的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)后在特定波長(zhǎng)發(fā)生吸光度變化，其變化程度與抗原量成正比，借助普通自動(dòng)生化分析儀即可準(zhǔn)確定量[13]。該方法具備了膠乳增強(qiáng)比濁的反應(yīng)模式，其靈敏度、線性范圍均優(yōu)于膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，且制作工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，不受原材料的限制，具備較好的推廣應(yīng)用基礎(chǔ)。

膠體金均相免疫反應(yīng)中抗原抗體反應(yīng)后在540 nm吸光度降低，同時(shí)在660 nm吸光度升高，其分析靈敏度比普通均相比濁法高[12-14]。另外，膠體金均相免疫比色技術(shù)減少了免疫反應(yīng)中的中間洗滌步驟，與免疫發(fā)光方法比較，提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本，便于基層醫(yī)院開(kāi)展[15]。

膠體金均相檢測(cè)技術(shù)克服了固相膠體金、免疫熒光層析技術(shù)無(wú)法準(zhǔn)確定量、無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)要求的缺點(diǎn)[12]，研發(fā)相對(duì)容易，材料成本低，綜合多方面的優(yōu)勢(shì)，其在實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)分析中擁有較大的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，h-FABP已與肌紅蛋白、肌鈣蛋白t/i、肌酸激脢被推薦為AMI聯(lián)合檢測(cè)的指標(biāo)，其在血液中出現(xiàn)時(shí)限早(<1 h)，靈敏度和特異度高，對(duì)早期AMI尤其具有診斷價(jià)值[16-19]。

針對(duì)h-FABP的檢測(cè)方法很多，但采用膠體金均相免疫檢測(cè)技術(shù)的方法尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用膠體金均相免疫技術(shù)初步建立了h-FABP膠體金均相法比色檢測(cè)體系，在臨床標(biāo)本的檢測(cè)分析中與成熟的化學(xué)發(fā)光法呈正相關(guān)(r=0.962)，以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值，符合率達(dá)95.09%。未能達(dá)到膠乳均相免疫檢測(cè)方法的檢出能力原因考慮為檢測(cè)體系尚不夠完善、制備的試劑組分與配比尚未完全達(dá)到臨床分析的要求、實(shí)驗(yàn)過(guò)程均為手工操作、誤差較大等多種因素。隨著后續(xù)檢測(cè)體系的不斷完善，檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確度會(huì)得到進(jìn)一步的改進(jìn)與提高。

4 結(jié) 論

通過(guò)系列研究與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確立了膠體金試劑制備的基本工藝與流程，初步完成了反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的建立，與成熟試劑檢測(cè)結(jié)果具有較好的符合率?？傮w而言，達(dá)到了預(yù)期目的，初步建立的h-FABP膠體金均相免疫比色法方法學(xué)簡(jiǎn)便，成本低廉，可實(shí)現(xiàn)生化分析儀的高通量快速分析，節(jié)約了大量的儀器與試劑成本，有利于在基層醫(yī)院開(kāi)展，在臨床標(biāo)本的定量分析中具有較大的應(yīng)用前景。