基于COI基因的柴達盆地常見寄生蚤種的DNA條形碼分析

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柴達木盆地在動物地理區(qū)劃上屬西部荒漠亞區(qū)，其蚤類區(qū)系以古北界種類為主，不少種屬為青藏高原特有種，具有較高的科學價值[1]。蚤類除因叮咬和吸血等行為對動物造成直接危害外，其傳播重大傳染病的媒介效能(如鼠疫、地方性斑疹傷寒等)也奠定了蚤類的重要醫(yī)學地位[2]。

醫(yī)學病媒生物的鑒定與識別，是控制疾病發(fā)生的核心步驟，也是疾病監(jiān)測的基礎工作。常規(guī)形態(tài)學手段要求分類人員必須掌握扎實的分類知識，同時需要保持被鑒定標本完整且典型的分類特征。目前分類學者人數(shù)急劇縮減，使分類鑒定工作面臨巨大挑戰(zhàn)，急切需要一種物種鑒定新方法產(chǎn)生。DNA條形碼技術的出現(xiàn)解決了形態(tài)鑒定的諸多困境[3-4]。在大多數(shù)動物類群中，線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)已被廣泛采納為通用的標準條形碼基因片段[5-7]。鑒于上述原因，我們對柴達木盆地寄生蚤種的COI基因序列進行研究，以彌補傳統(tǒng)形態(tài)分類法的不足，積累柴達木盆地寄生蚤COI基因部分序列的數(shù)據(jù)信息，探索建立醫(yī)學媒介生物快捷鑒定的新方法，這對整個動物學分子鑒定及遺傳學研究具有重要的學術意義。

1 材料與方法

1.1實驗材料 本研究使用的68份蚤DNA樣品，采自柴達木盆地1市2縣的68匹蚤(樣點分布如圖1)。將保存于75%酒精中的蚤樣本用眼科鑷輕輕攝出，置于解剖鏡下，用手術刀片將其腹部切開，再將單匹蚤體放入1.5 mL離心管中備用。根據(jù)QIAGEN試劑盒DNA提取步驟制備蚤DNA模板，并將模板置于-20 ℃保存。樣本來源詳見表1。

圖1 青海省部分蚤種樣本采集點信息 Fig.1 Sampling location of fleas used in present study in Qinghai

1.2PCR擴增 擴增體系：10×buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.15 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，最后用dd H2O補齊反應體系至25 μL。擴增條件：94 ℃預變性4 min后進行40個循環(huán)，94 ℃變性 1 min，其中前10個循環(huán)的退火溫度為55 ℃，后30個循環(huán)的退火溫度為50 ℃，退火時間均30 s。72 ℃延伸40 s。擴增時選用通用引物擴增COI基因片段[8]，引物序列L1490(5′-GTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′)和H2198(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′)。將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取條帶清晰樣品送北京擎科生物技術有限公司進行雙向測序(如圖2)。

圖2 PCR擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products

1.3DNA序列分析 首先用Chromos軟件觀察測序峰圖質(zhì)量，選取峰圖質(zhì)量較高的測序結果在NCBI上運行BLAST程序進行序列同源性比較，以確保所獲序列是目的序列。再用Clustal X軟件[9]進行多重序列比對，將比對結果導入Mega 6.0軟件[10]，基于Kimura-2-parameter模型[11]進行堿基組成計算和分析、序列信息位點檢測、轉(zhuǎn)換數(shù)與顛換數(shù)及其比值等。

2 結 果

2.1蚤類COI基因部分序列描述 共測得3總科5科11屬19種蚤計68條COI序列，另外從GenBank中查詢的蚤類同源序列經(jīng)Mega 6.0軟件進行序列組成分析，結果顯示COI基因序列中保守位點有336個，變異位點有261個，簡約信息位點有252個，自裔位點有9個。同時A、T、C、G堿基的平均含量分別為27.2%、39.7%、17.7%、15.4%，其中A+T含量(66.9%)遠高于G+C含量(33.1%)，與目前已測線粒體DNA序列中較高的A+T含量現(xiàn)象相一致。

由表2可以看出，COI基因序列的堿基轉(zhuǎn)換值明顯高于顛換。T、C間的轉(zhuǎn)換平均數(shù)是204，A、G間的轉(zhuǎn)換平均數(shù)是137，TC轉(zhuǎn)換大于AG間的轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換/顛換的平均值0.08，轉(zhuǎn)換主要發(fā)生于A-G之間，顛換主要發(fā)生于T-A之間。第1位點R值最小，僅0.78，說明第一位點的替換多是同義替換，不會導致氨基酸的改變。

2.2NJ法構建系統(tǒng)樹 運用Mega 6.0軟件，基于Kimura-2-parameter模型，采用NJ鄰接法構建柴達木盆地常見寄生蚤COI基因序列的NJ樹(圖3)，對NJ樹進行內(nèi)部分支檢驗與1 000次Bootstrap檢驗分析，來確定各支系的置信度。

表2 柴達木盆地蚤類COI基因堿基替換數(shù)Tab.2 Base substitutions on COI gene of fleas from Qaidam Basin

圖3 基于Kimura-2-parameter模型構建蚤類NJ系統(tǒng)樹Fig.3 A neighbor-joining phylogenetic tree of fleas based on Kimura 2-parameter model

3 討 論

3.1遺傳距離差異 柴達木盆地19種蚤的COI序列其平均遺傳距離為16.1%，種內(nèi)遺傳距離0.01%～2.9%，種間遺傳距離3%～15.4%，種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離。種屬間遺傳距離如圖4所示。

圖4 柴達木盆地蚤類COI基因部分序列遺傳距離差異分析Fig.4 Analysis of genetic distance on partial COI gene sequence of fleas from Qaidam Basin

3.2形態(tài)結果的修訂 本研究中我們挑選了形態(tài)特征比較明顯的非透明蚤標本做分子實驗，即便這樣，在分析和比對本研究的蚤類COI基因部分序列時，我們也發(fā)現(xiàn)一些種類的形態(tài)鑒別可能存在誤定問題，尤其是雌蚤的鑒定結果。例如編號Z138的雙蚤雌蚤(符合雙蚤屬屬征：僅有胸櫛，腹節(jié)背板有副鬃列，眼鬃位于眼的上方、觸角窩的前緣，眼的前方有可見的幕骨拱，后足第5跗節(jié)4對側蹠鬃、1對蹠鬃)，且第7腹板后緣較平，初鑒為原雙蚤指名亞種；編號Z147、Z148的雌蚤在鏡檢時也符合雙蚤屬的屬征，但第7腹板后緣具淺凹，下段不外斜，初步鑒定為方指雙蚤。這3匹雌蚤均采自格爾木白尾松田鼠體表，因該地區(qū)未采到相應雄蚤，先暫以形態(tài)鑒定命名。在后續(xù)工作中發(fā)現(xiàn)這3匹蚤和GeneBank登錄號為MG138278、MG138279的直緣雙蚤指名亞種的雄蚤聚為一支，且置信度為99%。根據(jù)蚤類形態(tài)鑒別以雄性為主，雌性為輔的特性，所以我們在分子結果分析時結合現(xiàn)場鑒定結果、宿主和地區(qū)分布等綜合考量，將這3匹雌蚤復鑒為直緣雙蚤指名亞種。

實際工作應用中，一些雌蚤種一級的分類特征差異很小，我們在形態(tài)分類時只能鑒定到屬，無法鑒定到種。若想細分，最好在同地區(qū)再次補點進行樣本采集，以期獲得該屬雄蚤，看能否和雌蚤進行配對鑒定。如果雄蚤特征不匹配或現(xiàn)場補樣條件不允許，可通過分子試驗的COI基因數(shù)據(jù)在GeneBank基因庫中比對后，再綜合分子聚類結果和現(xiàn)場樣本采集信息進行準確分類鑒定。

鑒于形態(tài)常規(guī)分類存在鑒定錯判的可能，今后蚤類鑒定應以外部形態(tài)鑒定為主，結合分子鑒定結果，可更好地發(fā)現(xiàn)和糾正傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定中的錯誤，從而準確鑒別物種。

3.3系統(tǒng)樹的構建和存在的問題 構建的系統(tǒng)樹顯示所有個體形成19個高支持度的單一分支，提示蚤種類應該有19種，這和蚤憑證標本復核結果大致一致，說明DNA條形碼技術可用于蚤類的鑒定。

形態(tài)鑒別結果為禿病蚤田鼠亞種和禿病蚤指名亞種的COI基因序列在NJ樹中卻聚為一個分支，置信度100%，考慮亞種在形態(tài)鑒別中的很多問題和歧義等實際問題，筆者認為把這一分支直接定為種的階元-禿病蚤，而不再往下細分更為合理些。

NJ樹中長鬃雙蚤和共和雙蚤分支蚤種鑒定出現(xiàn)問題最多，暫時把這兩個雙蚤分支歸為疑似長鬃雙蚤、疑似共和雙蚤類群。我們再三復核這兩個分支的憑證標本，最后分析出現(xiàn)的問題原因大致有二，一是雙蚤屬雌蚤形態(tài)鑒定只能憑第7復板后緣凹陷的深淺及廣度，差別細微，主觀性較強，極易造成誤鑒或只能粗略鑒定到屬。二是雄蚤形態(tài)復鑒無誤，但分子結果卻和形態(tài)結果不相一致的問題。例如，1匹雄蚤形態(tài)鑒定為長鬃雙蚤，復檢透明標本后我們認為形態(tài)鑒別無誤，但它卻和共和雙蚤聚為一支。關于這些形態(tài)極其相似、地理分布相近的蚤種分類，建議今后在形態(tài)分類基礎上開展多基因分子標記，尤其是線粒體基因和核基因聯(lián)合標記研究，以便精準分析種群遺傳多樣性和系統(tǒng)進化發(fā)育。

綜上所述，盡管DNA條形碼鑒定技術前景非常樂觀，但目前分子鑒定技術的正確做法還是應以傳統(tǒng)分類法為基礎，保證分類物種為純種且鑒別正確，在此基礎上測定的COI基因序列才能作為該物種的DNA條形編碼。并盡可能留存憑證標本，以供其他學者對形態(tài)數(shù)據(jù)和基因數(shù)據(jù)進行相關研究時做一參比。