腦脊液相關(guān)標志物檢測在阿爾茨海默病癡呆診斷中的應(yīng)用

孫云闖 金海強 孫永安 白靜 黃一寧

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,AD）是最常見的神經(jīng)變性病癡呆，其早期（無癥狀期或輕度認知障礙期）的診斷困難，PET淀粉樣蛋白顯像和腦脊液標志物檢測 （Aβ42、T-tau和P-tau181）是最主要的方法[1]。腦脊液標志物檢測方法簡單易行，更容易進行廣泛推廣。國際上很多國家已開展了AD相關(guān)腦脊液標志物的檢測，但各實驗室間及實驗室內(nèi)部批次間檢測的變異性較高[2-3]，因此建議各實驗室建立自己的正常范圍及界定值[4]。我國尚未開展AD相關(guān)腦脊液標志物的常規(guī)檢測。為此，借鑒相關(guān)指南的推薦[5-6],我們對腦脊液標本采集、儲存、檢測程序等步驟進行了更新，目的是探索AD 相關(guān)腦脊液標志物（Aβ42、 T-tau、 P-tau181、Aβ42/T-tau和 Aβ42/P-tau181）檢測方法的可靠性，驗證其在我國應(yīng)用的可行性，界定我中心各檢測標志物的界定值（cutoff值），為進一步廣泛開展該項檢測提供經(jīng)驗。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1AD癡呆組2015年7月至2017年2月因記憶力下降就診于北京大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的AD癡呆患者，所有患者均符合2011年NIA-AA指南典型AD型癡呆的核心臨床診斷標準[7]，且包括：①年齡50～80歲；②病程1年以上；③均完成頭MRI平掃；④神經(jīng)心理量表測驗包括簡易精神狀態(tài)檢查（mini-mental state examination，MMSE），MMSE＜26，蒙特利爾認知評估量表（montreal cognitive assessment,MoCA）檢查；⑤部分患者按統(tǒng)一方案完成匹茲堡復合物PET（Pib-PET）檢查[8]；所有AD型癡呆均經(jīng)有經(jīng)驗的專業(yè)醫(yī)生綜合患者的資料等進行診斷。

排除標準：以非記憶力下降為主要表現(xiàn)的患者或不典型AD患者；臨床、影像等輔助檢查提示其他類型的癡呆如血管性癡呆、額顳葉癡呆、路易體癡呆以及頭MRI發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)占位、正常顱壓腦積水、明顯腦白質(zhì)病變、明顯腦血管病影像等改變的患者。

1.1.2認知正常組 選取2015年7月至2017年2月間于北京大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院行腰穿的年齡80歲以下患者，主要包括周圍神經(jīng)病、脊髓病、腰骶神經(jīng)根病、神經(jīng)痛等無頭部癥狀的患者，以及頭痛、腦膜炎、癲癇、錐體外系疾病、特發(fā)性高顱壓等有顱腦癥狀但頭MRI無明確腦實質(zhì)受累的患者，所有患者均否認有記憶等認知功能下降并經(jīng)家屬證實；所有AD癡呆組及認知正常組均經(jīng)本人或家屬簽字同意行腰穿檢查；

1.2 檢測方法受試者腦脊液留取及儲存方法均按2012年VANDERSTICHELE等[5]推薦的方法，具體如下：所有受試者均由有經(jīng)驗的腰穿操作者進行腰穿檢查，穿刺間隙首選L4/5間隙，穿刺不成功者在L3/4間隙進行，確認腦脊液外觀清亮后將其留取至PP管，并分別行腦脊液常規(guī)、生化、涂片等檢查，留取最后一管2mL擬作為AD標志物檢測。腰穿結(jié)束后3h內(nèi)將其轉(zhuǎn)移至1.5mL PP管內(nèi)，并放至-80°冰箱內(nèi)冷凍保存至檢測之日。

腦脊液Aβ42、T-tau和 P-tau181均采用 Innotest試劑盒，用ELISA方法進行，檢測由有一名經(jīng)驗豐富的操作者在不知受試者診斷情況下獨立進行，腦脊液標本均采用雙副孔檢測，按標準檢測步驟分別進行加樣、洗板、過夜，最后經(jīng)酶標儀分光度測定。將測定數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后采用非線性四參數(shù)曲線方法對腦脊液 Aβ42、T-tau和 P-tau181進行取值，Aβ42/T-tau、Aβ42/P-tau181經(jīng)上述取值后計算得出。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示；計數(shù)資料采用頻數(shù)（百分比）表示；正態(tài)分布的兩組統(tǒng)計學比較采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布的兩組統(tǒng)計學比較采用非參數(shù)檢驗；采用ROC曲線計算 youden 指數(shù)進行 CSF Aβ42、T-tau、P-tau181、Aβ42/T-tau和Aβ42/P-tau181診斷兩組人群的界定（cutoff）值，并以此計算各指標敏感性和特異性；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況本研究共入組符合入組標準的AD癡呆17例，其中輕度癡呆8例，中度癡呆7例，重度癡呆2例，12例患者完成MMSE評分，中位MMSE評分15分，8例患者完成MoCA評分；5例患者完成匹茲堡復合物PET檢查；認知正常組49例。兩組人口學資料及各檢測指標統(tǒng)計學比較見表1：兩組性別差異無統(tǒng)計學意義，在年齡及腦脊液各檢測指標差異均有統(tǒng)計學意義；正常組年齡較AD癡呆組??；正常組 Aβ42、Aβ42/T-tau、Aβ42/P-tau181值較 AD癡呆組低，T-tau和P-tau181值較AD癡呆組高

表1 正常組和AD癡呆組人口學資料及各檢測指標

2.2 對各檢測指標繪制ROC曲線見圖1，ROC曲線相關(guān)數(shù)值見表2，結(jié)合ROC曲線計算youden指數(shù)得出各檢測指標的cutoff值，并計算其敏感性及特異性見表3。結(jié)果顯示，所有ROC曲線指標在鑒別AD型癡呆組及認知正常組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001），Aβ42/T-tau曲線下面積最大，其次為 Aβ42/P-tau181；Aβ42/P-tau181對鑒別 AD型癡呆與正常對照的敏感性和特異性最好，其次是 Aβ42/T-tau；Aβ42和 P-tau181對鑒別兩組的特異性較好，但敏感性較差，而T-tau鑒別兩組的敏感性較好，但特異性較差。以上結(jié)果提示，本研究中所有檢測指標應(yīng)用均有一定的意義。

表2 各指標ROC曲線相關(guān)參數(shù)及統(tǒng)計學檢驗

3 討論

表3 各檢測指標cutoff值及其診斷AD癡呆的敏感性（sen）和特異性（spe）

圖1 各檢測指標ROC曲線

隨著對AD研究的不斷深入，AD相關(guān)腦脊液標志物在AD早期診斷中的作用越來越重要。近年來更新的國際AD診斷指南中，腦脊液標志物的地位不斷提高[1,7]。但由于實驗條件的不同以及標志物本身問題，各實驗室檢間及實驗室內(nèi)部批次間檢測的變異性均較高[2-3]，因此目前尚無統(tǒng)一的各標志物的正常取值范圍，國際上建議各實驗室建立自己的正常值范圍及界定值[4]。我國目前在檢測方法上尚無廣泛研究，結(jié)合本實驗室既往檢測腦脊液Aβ42水平的經(jīng)驗及國際相關(guān)指南的推薦，我們對檢測方法進行了更新，通過對AD癡呆人群及認知正常人群腦脊液AD相關(guān)標志物檢測結(jié)果，本研究顯示：AD癡呆組各腦脊液標志物與認知正常組差異具有統(tǒng)計學意義，正常組 Aβ42、Aβ42/T-tau和 Aβ42/P-tau181值較 AD 組低，T-tau和P-tau181值較AD癡呆組高；各指標均能鑒別正常認知組及AD癡呆組；該結(jié)果符合AD病理生理機制中相應(yīng)標志物的變化趨勢[9]。本研究得到了各指標診斷AD癡呆人群的cutoff值，各指標界定值均接近國外研究報道的cutoff值[9]。這些結(jié)果表明，AD相關(guān)腦脊液標志物檢測方法在我國是可行的，我國人群各指標接近國外人群檢測值，該方法可進行廣泛開展及推廣。

本研究中各檢測指標診斷AD型癡呆與正常人群比較的敏感性和特異性顯示：各指標特異性較敏感性更好，目前國際上推薦PET淀粉樣蛋白分子顯像和腦脊液標志物主要用于不典型AD患者的診斷以及輕度認知障礙患者是否由AD所致[10]，因此腦脊液標志物較高的特異性有助于排除AD的診斷進而尋求其他導致患者認知損害的原因。就單個指標而言，Aβ42/P-tau181的敏感性和特異性最好，該結(jié)果與國外文獻報道基本一致[11-12]，目前認為，Aβ42/P-tau181或Aβ42/T-tau的敏感性和特異性均較高，且不同試驗間數(shù)值穩(wěn)定，越來越被認為是診斷AD腦脊液標志物中更為可靠的指標，尤其是Aβ42/P-tau181水平更為穩(wěn)定。我們在研究中也有類似體會，認知正常組不同試驗間Aβ42、T-tau、P-tau181均有較大波動，尤其是 Aβ42最為明顯，但 Aβ42/P-tau181或 Aβ42/T-tau 相對較穩(wěn)定，提示 Aβ42/P-tau181或 Aβ42/T-tau比值在 AD診斷中的作用可能更大。

在AD病理生理過程中，Aβ42通常在臨床癥狀出現(xiàn)前多年最先開始沉積形成老年斑，之后是P-tau的沉積形成神經(jīng)元纏結(jié)，腦脊液標志物和PET淀粉樣蛋白分子顯像均能起到早期診斷作用，兩者作用類似，但哪種方法更為準確以及兩種檢查手段結(jié)果不一致情況該如何解釋目前尚無定論[13-14]。本研究中亦有PET和腦脊液標志物“不一致”情況出現(xiàn)：AD癡呆組共有5例完成淀粉樣蛋白分子顯像，其中4例顯像陽性，1例為顯像陰性。4例陽性患者中有3例呈現(xiàn)出典型AD患者的腦脊液標志物變化，即Aβ42水平降低而T-tau、P-tau181水平升高，1例患者 Aβ42及 Aβ42/P-tau181水平降低而T-tau、P-tau181水平正常；1例匹茲堡顯像陰性的患者其 Aβ42、T-tau、P-tau181水平均在正常范圍。國外文獻關(guān)于兩者結(jié)果不一致情況的原因認為[15-17]：一方面，匹茲堡顯像與尸檢一致率較高，但亦有匹茲堡顯像陰性而尸檢符合典型AD表現(xiàn)者，原因可能包括：匹茲堡示蹤劑僅能與彌漫性淀粉樣斑塊結(jié)合而不能與可溶性或致密性斑塊結(jié)合，而后兩者亦為AD病理中較為常見的表現(xiàn)；腦脊液Aβ42水平降低通常早于老年斑形成，腦脊液標志物異常而PET顯像陰性者可能處于疾病早期，但無法解釋患者已處于明顯癡呆階段的情況；另一方面，從檢測方法的可靠性上看，腦脊液標志物的檢測方法存在一定程度的不穩(wěn)定，進而可能出現(xiàn)腦脊液標志物陰性而PET陽性的情況[18]。但兩者不匹配的原因仍缺乏大規(guī)模研究，需更多研究尤其是尸檢患者的情況進一步明確。

本研究存在一些不足，首先研究人群的樣本量偏少，尤其是AD癡呆組；其次，正常認知組中缺少完全正常的健康對照，部分患者有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。且對照組年齡較AD癡呆組輕，有文獻報道年齡對Aβ42水平無影響，對Tau水平有一定影響，因此研究結(jié)果的擴展受一定影響[19]。但考慮到在我國老年期癡呆及健康人群中進行腰穿檢查有一定難度，因此本研究結(jié)果仍有一定意義，未來仍需進一步擴大樣本量并進行年齡分組研究；第三，AD癡呆組中部分患者為中重度癡呆，早期癡呆病例數(shù)少，但研究表明Aβ42及P-tau蛋白的沉積在癡呆不同程度中無明顯差異，因此，AD癡呆組人群結(jié)論仍有意義。未來研究工作中，仍需要在不同癡呆程度及輕度認知障礙人群中進行更深一步的研究。