4個抗稻瘟病基因在秈稻資源中的分布

李培江，張選明，沙志鴻，劉志奇，周 凱，嚴(yán)洪慶，顧朝軍

(陜西省水稻研究所，陜西 漢中 723000)

【研究意義】水稻(Oryzasativa)是我國重要的糧食作物之一，由子囊真菌(Magnaporthegrisea)引起的稻瘟病已成為水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的嚴(yán)重阻礙，其危害面積與危害程度日趨嚴(yán)重[1-2]。實踐證明，選育抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，而鑒定和篩選品種資源的抗瘟基因型是選育抗性品種的首要前提[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，越來越多的國內(nèi)外學(xué)者對抗稻瘟病基因做出報道，截至2015年3月，已至少報道了69個抗稻瘟病位點(diǎn)共84個主效基因。其中，Pita、Pib、Piz-t,、Pi9等24個基因已被成功克隆，并開發(fā)出了特異性分子標(biāo)記[4]。Pi-ta和Pib是最早分別從日本抗性材料BL-1、Tetep中克隆的抗稻瘟病基因，王忠華等利用抗稻瘟病基因Pita自身序列分別設(shè)計出能擴(kuò)增抗病等位基因Pita的特異性引物YL155/YL87，和感病等位基因Pita的特異性引物YL183/YL87[5-6]。Pi-b基因位于水稻第2 染色體長臂近末端區(qū)域，Robert等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列設(shè)計出能擴(kuò)增抗病等位基因Pib的特異性引物Pibdom[7]。劉洋等利用抗稻瘟病基因Pib自身序列設(shè)計出能擴(kuò)增感病等位基因Pib的特異性引物L(fēng)ys145[8]。Pi-9是已克隆的抗譜最廣的基因，也是一個具有NBS-LRR 結(jié)構(gòu)的抗性基因，它與Pi-2、Pi-zt、Pi-gm是復(fù)等位基因，同Pi-2和Pi-zt僅有8個氨基酸的差異，并找到了與該基因緊密連鎖的分子標(biāo)記PB8[9]。戴小軍等利用抗稻瘟病基因Pi-9自身序列設(shè)計特異性顯性標(biāo)記PB8[10]。華麗霞等通過序列比對，開發(fā)出Pi-zt特異性顯性分子標(biāo)記Pizt-PA[11]。利用這些標(biāo)記可以快速準(zhǔn)確地從水稻資源中鑒定并篩選含有抗性基因Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt的材料。【本研究切入點(diǎn)】本研究利用Pita、Pib、Pi-9和Pi-zt基因的特異性分子標(biāo)記對漢中地區(qū)73份材料進(jìn)行抗瘟基因型檢測，鑒定其抗性基因型背景，初步建立抗性基因數(shù)據(jù)庫，減少抗病育種的盲目性，提高育種效率。【擬解決的關(guān)鍵問題】為抗稻瘟病基因分子輔助聚合育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所現(xiàn)存和外引的73份水稻材料，材料的名稱和類型見表2。

1.2 菌株來源及接種調(diào)查

室內(nèi)抗譜選用的菌株均采自自住栽培品種，主要來源于漢中高發(fā)稻瘟病區(qū)域。根據(jù)最近幾年稻瘟病菌生理小種的致病性測定情況選出的代表性菌株，所有菌株均保存于漢中市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保室。菌株的培養(yǎng)、活化、繁殖均按照常規(guī)方法，選取濃度適中的孢子懸浮液進(jìn)行人工噴霧接種，接種1周后進(jìn)行調(diào)查。病級調(diào)查按照國際水稻所稻瘟病圃苗瘟分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，0～3級為抗，4～9級為感。

1.3 水稻基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

采集分蘗盛期的試驗材料葉片，用CTAB法提取全基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系為20 μl：2 μl 10× buffer，2 μl DNA，2 μl dNTP，1 μl正反引物，0.5 μl MgCl2，0.5 μlTaq酶，11 μl蒸餾水，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃45 s，擴(kuò)增重復(fù)34次，72 ℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，紫外燈下觀察和檢測。為保證實驗的可靠性，每個DNA 樣品重復(fù)3次。

1.4 引物選擇

利用Pi-ta基因特異性分子標(biāo)記YL155/YL187對供試材料進(jìn)行檢測，以能擴(kuò)增出1042 bp目標(biāo)片段的為含有Pi-ta基因；利用Pi-9基因特異性分子標(biāo)記PB8對供試材料進(jìn)行檢測，以能擴(kuò)增出500 bp目標(biāo)片段的為含有Pi-9基因；利用Pi-b基因特異性分子標(biāo)記Pi-bdomF/Pi-bdomR對供試材料進(jìn)行檢測，以能擴(kuò)增出365 bp目標(biāo)片段的為含有Pi-b基因；利用Pi-zt基因特異性分子標(biāo)記對供試材料進(jìn)行檢測，以能擴(kuò)增出176 bp目標(biāo)片段的為含有Pi-zt基因。用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的引物名稱、序列和擴(kuò)增片段預(yù)期大小(表1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個稻瘟病抗性基因分子鑒定及其分布

圖1～4分別為抗性基因Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt在部分材料中的檢測結(jié)果，表2為73份材料的檢測結(jié)果。由表2可以看出，73份材料中有3個材料含有Pi-ta基因；10個材料含有Pi-9基因；13個材料含有Pi-b基因；72個材料含有Pi-zt基因。從表2還可以發(fā)現(xiàn)，73份供試材料中54個含有1個基因，13個含有2個基因，6個含有3個基因，未見含有4個基因的材料。

在檢測的材料中，抗性基因Pi-zt的頻率最高，檢出率為98.6 %，其次為抗性基因Pi-b和Pi-9，檢出率分別為17.8 %和13.7 %，檢出頻率最低的是Pi-ta，為4.1 %。

2.2 檢測的抗稻瘟病基因數(shù)量、類型與抗病相關(guān)性分析

對4個抗性基因在73份水稻材料中的分布與抗性分析表明，73份材料中含3個基因的有6個，其中5個表現(xiàn)為抗性水平(Pi-9+Pi-b+Pi-zt)，1個表現(xiàn)為感性(Pi-ta+Pi-b+Pi-zt)；含2個基因的有13個，含Pi-b+Pi-zt有6個，5個表現(xiàn)為感性水平，1個表現(xiàn)為抗性水平(360A)，含Pi-9+Pi-zt有5個，4個表現(xiàn)為感性水平，1個表現(xiàn)為抗性水平(R669),含Pi-ta+Pi-zt有2個，均表現(xiàn)為感性水平，表明這幾個基因聚合在一起抗性比較弱。含有1個基因的有54個，53個含有Pi-zt，1個含有Pi-b，54個中17個表現(xiàn)為抗性水平，16個含有Pi-zt的表現(xiàn)為抗性，1個含有Pi-b表現(xiàn)為抗性，這并不意味著2個基因的抗性水平高，應(yīng)該是還攜帶著其他的抗性基因。

表1 用于PCR反應(yīng)的引物名稱、序列和擴(kuò)增片段預(yù)期大小

M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL2000 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182圖1 部分材料Pi-ta基因的擴(kuò)增Fig.1 PCR results of gene Pi-ta in some materials

M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: 理想S; 7: 川浙A; 8: 327B; 9: 泰豐A; 10: R146; 11: R387; 12: 蜀恢527; 13: R25; 14: 恩恢85; 15: 蜀恢527; 16: IR26; 17: 多絲一號; 18: IR26; 19: R669; 20: R208M: DL100 marker; 1: 318A; 2: Y58S; 3: 909S; 4: 川106A; 5: 360A; 6: LixiangS; 7: ChuanzheA; 8: 327B; 9: TaifengA; 10: R146; 11: R387; 12: Shuhui527; 13: R25; 14: Enhui85; 15: Shuhui527; 16: IR26; 17:Duosiyihao; 18: IR26; 19: R669; 20: R208圖2 部分材料Pi-9基因的擴(kuò)增Fig.2 PCR results of gene Pi-9 in some materials

M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: 成恢727; 5: R150; 6: 成恢177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: 宜恢1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182M: DL100 marker; 1: R126; 2: R150; 3: IR24; 4: Chenhui727; 5: R150; 6: Chenhui177; 7: IR24; 8: R563; 9: R225; 10: R115; 11: Yihui1108; 12: R263; 13: R1025; 14: R1026; 15: 2208B; 16: R675; 17: R676; 18: R491; 19: R138; 20: R182圖3 部分材料Pi-b基因的擴(kuò)增Fig.3 PCR results of gene Pi-b in some materials

M: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: 素92B; 7: 中嘉B; 8: 中88B; 9: 28早-1B; 10: 28早-2B; 11: 青56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: 川浙B; 19: 279-2B; 20: 283BM: DL100 marker; 1: 768-5B; 2: 2020-1B; 3: 2020-2B; 4: 2020-3B; 5: 2020-4B; 6: Su92B; 7: ZhongjiaB; 8: Zhong88B; 9: 28Zao-1B; 10: 28Zao-2B; 11: Qing56B; 12: 2122B; 13: N23B; 14: 2150B; 15: 278B; 16: 279B; 17: 279-1B; 18: ChuanzheB; 19: 279-2B; 20: 283B圖4 部分材料Pi-zt基因的擴(kuò)增 Fig.4 PCR results of gene Pi-zt in some materials

通過進(jìn)一步分析在含Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt等不同的抗性基因?qū)μ嵘究剐灶l率的貢獻(xiàn)，結(jié)果顯示，不同的抗性基因?qū)μ嵘究剐缘呢暙I(xiàn)不同，其中，攜帶Pi-b基因的材料中，表現(xiàn)為抗性材料的頻率為61.5 %；攜帶Pi-9基因的材料中，表現(xiàn)為抗性材料的頻率為60 %；攜帶Pi-zt基因的材料中，表現(xiàn)為抗性材料的頻率為34.7 %。結(jié)果表明，Pi-b和Pi-9在漢中地區(qū)表現(xiàn)出較好的抗瘟性，對該地區(qū)的抗瘟性貢獻(xiàn)較大。尤其是同時含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt3個基因的材料中，抗病率百分之百，表明3個基因聚合在一起，能夠表現(xiàn)出較好的抗性。

表2 供試材料分子標(biāo)記檢測結(jié)果和抗性反應(yīng)

續(xù)表2 Continued table 2

序號 Code材料名稱Name of materialPi-taPi-9Pi-bPi-zt合計Total抗感性Reactions39909S---+1S40川106A--++2S41360A--++2R42理想S---+1S43川浙A-+-+2S44327B--++2S45泰豐A-+++3R46R146---+1R47R387---+1R48R25---+1S49恩恢85---+1R50蜀恢527+--+2S51IR26---+1R52多絲一號---+1R53R669-+-+2R54R208---+1R55R126--+-1R56R150---+1S57成恢727---+1R58R150+--+2S59成恢177+-++3S60IR24--++2S61R563---+1R62R225---+1R63R115---+1R64宜恢1108---+1S65R263-+++3R66R1025-+++3R67R1026-+++3R682208B---+1S69R675---+1R70R676---+1R71R491---+1R72R138---+1R73R182---+1R合計Total3101372

注：“+”含該基因；“-”不含該基因；R：抗??； S：感病。

Notes: ‘+’indicated that the gene were contained; ‘-’ indicated that the gene were not contained; R: Resistant; S: Susceptible.

3 討 論

由于稻瘟病病菌具有耐藥性、易變異等特點(diǎn)，因此，同一稻區(qū)和不同稻區(qū)的稻瘟病菌有所不同，品種的抗病性往往表現(xiàn)出巨大差異，導(dǎo)致單一抗性品種不能夠長效的保持抗性。實踐證明，培育抗性品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。傳統(tǒng)的抗性育種主要依賴于表現(xiàn)型的特點(diǎn)，而表現(xiàn)型容易受環(huán)境以及人為因素的干擾，從而降低了選育結(jié)果的可靠性及抗病育種效率。而分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)不受外部環(huán)境的影響，分析手段快速簡便，即保證了結(jié)果的可靠性，又能提高育種效率。因此，通過傳統(tǒng)育種方法結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)是進(jìn)行抗病育種的有效手段。劉仕平等[12]研究表明，多個抗性基因的聚合后，并不簡單的是單個抗病基因的抗譜之間的簡單累加，而是抗性基因之間表現(xiàn)為極顯著的基因互作，從而促使抗譜拓寬，抗性增強(qiáng)，使其能夠抵抗單個抗病基因不能抵抗的生理小種。一個材料中含有的抗病基因數(shù)量越多，其抗性材料的出現(xiàn)頻率可以得到相應(yīng)提升，但是也不盡然，還需要看含有的抗性基因是否有顯著的基因互作。為了減少基因聚合的盲目性，增加目的性和可靠性，通過分子標(biāo)記了解水稻材料中的抗性基因背景。如李進(jìn)斌[13]等和劉華招[14]等利用pita和pib抗性基因分子標(biāo)記分別對云南種植稻種和黑龍江種植稻種中2個基因的分布進(jìn)行了鑒定分析。時克等[15]利用分子標(biāo)記檢測了58個水稻品種的Pita和Pib基因的分布狀況。何重等[16]利用Pi-ta和Pi-b基因標(biāo)記，對江蘇地區(qū)粳稻品種進(jìn)行了基因檢測，明確了抗性基因Pi-ta和Pi-b在江蘇粳稻品種中的分布，且Pi-b的分布頻率較高。張羽[17]等通過分子標(biāo)記檢測了陜西省水稻種質(zhì)資源中Pi-9基因的分布狀況，并指出陜西省主要水稻種質(zhì)資源中Pi-9基因所占比例較少。戴小軍等對70 個水稻稻瘟病感抗病品種進(jìn)行了Pi-ta、Pi-b、Pi-9 以及Pi-km 基因檢測，初步建立了抗性基因數(shù)據(jù)庫。

4 結(jié) 論

本研究對漢中地區(qū)73份水稻材料進(jìn)行了Pi-ta、Pi-9、Pi-b和Pi-zt基因檢測，了解了4個基因的分布以及對抗稻瘟病的貢獻(xiàn)。通過4個基因的分布頻率以及貢獻(xiàn)率發(fā)現(xiàn)，供試材料中4個基因都有分布，分別檢測到有含3個基因，2個基因以及1個基因的材料，其中Pi-zt的分布頻率最高，且大部分材料只含有這1個基因，大部分表現(xiàn)感病，個別表現(xiàn)出抗病，表現(xiàn)抗病的材料應(yīng)該是含有其他抗性基因，而Pi-zt基因在抗病圃里應(yīng)該是減弱或已喪失抗性。Pi-9和Pi-b的分布頻率和貢獻(xiàn)率差不多，在基因聚合中，Pi-b+Pi-zt有6個，5個表現(xiàn)為感性水平，1個表現(xiàn)為抗性水平，含Pi-9+Pi-zt有5個，4個表現(xiàn)為感性水平，1個表現(xiàn)為抗性水平，含Pi-ta+Pi-zt有2個，均表現(xiàn)為感性水平。而同時含有Pi-9、Pi-b和Pi-zt的材料均表現(xiàn)為抗性。由于Pi-zt普遍存在，同時聚合Pi-9和Pi-b是提升材料抗性的一種手段。通過本研究，初步建立了抗性基因數(shù)據(jù)庫，為聚合多基因提升水稻抗性提供依據(jù)。本實驗所選材料和抗性基因較少，不能解決所隱藏的問題，如只含Pi-zt基因所表現(xiàn)抗性的材料，其還含有哪些基因來提升抗性；聚合3個或多個基因的材料抗性是否強(qiáng)于1個或2個基因的材料抗性等。下一步將繼續(xù)擴(kuò)大群體和基因數(shù)量，進(jìn)一步完善漢中地區(qū)抗性基因數(shù)據(jù)庫，為水稻抗病育種提供資源。