單春蘭,高飛龍,劉超英,劉海峰,高 洪*,嚴玉霖,楊 偉,王 浩
(1. 云南農業(yè)大學動物科技學院,云南 昆明 650201; 2. 云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院,云南 昆明 650201)
【研究意義】隨著人類生活水平的不斷提高,食品安全問題和自身健康問題越來越引起了人們的普遍關切?!厩叭搜芯窟M展】蘇丹紅I(Sudan I)是一種人工合成的親脂性偶氮化合物,常用于工業(yè)生產中,其可通過多種途徑代謝,在代謝過程中產生活性氧,主要作用與肝臟靶器官。Sudan I及其代謝產物能夠導致細胞不斷分裂和增殖,并能抑制細胞凋亡,從而促進腫瘤細胞的生長。Omura等在1964年于大鼠的肝微粒體中發(fā)現(xiàn)的酶系CYP 450s(Cytochrome P450s,CYPs),分布于哺乳動物的肝、胃腸道、腎、腦、肺、皮膚及胎盤組織[1-2]。其中肝臟是其含量最高的場所,存在于肝細胞的內質網、線粒體和核膜上。CYP 450s是存在于肝臟內重要的藥物代謝酶,主要參與了內源性物質和外源性物質在肝臟內的代謝,也是致癌物代謝活化的一類重要酶系[3-5]。CYP 2家族細胞色素中CYP 2E1可被乙醇等化合物誘導,是參與N-亞硝胺、苯胺、鹵代烴類等多種前致癌物代謝為終致癌物的主要酶類[6]。CYP 3A能被多種化合物所誘導,在許多毒理學和藥物代謝方面具有重要意義[7]。血液成分中的白細胞、紅細胞、血小板和血紅蛋白對機體發(fā)生病理改變最具有診斷參考價值[8]。白細胞是動物機體防御系統(tǒng)的重要組成部分,數(shù)目增高見于急性中毒、組織損傷、細菌病毒的感染等等;紅細胞數(shù)目的減少見于造血發(fā)生障礙容易形成貧血或受到物理化學因素破壞;血小板量數(shù)目增高表現(xiàn)血液粘稠度增大,血栓形成等疾病;血紅蛋白反應機體的貧血程度[9]。【本研究切入點】本實驗研究擬用對照組(C組)、Sudan I處理組實驗動物SD大鼠,建立肝臟病理性損傷的中毒動物模型?!緮M解決的關鍵問題】采用酶活性的測定和血液分析探討CYP 450s酶系活性的變化,對闡明Sudan I致肝損傷機理以及建立Sudan I中毒病理性評價標準等方面具有重要意義。
蘇丹紅I(Sudan I),購于國藥集團化學試劑有限公司;氨基比林,購于上海國藥公司;BCA蛋白定量測試盒,購于昆明峰大進出口有限公司;還原性輔酶II、紅霉素,購于Roche公司;蔗糖、連二亞硫酸鈉(保險粉)、氯化鈣、硫酸、硫酸鋅、醋酸胺、氫氧化鋇、乙酰丙酮、甲酸、氯仿、異丙醇、乙醇等為國產分析純試劑。
HWS-20型恒溫水浴箱,購于江蘇太倉市實驗設備廠;PHB-3pH酸度計,購于寧波石浦海天電子儀器廠;LD4-2A型低速離心機,購于北京醫(yī)用離心機廠;DANGERSJ-CJ-1F型超凈工作臺,購于蘇州蘇潔凈化設備有限公司;Beckman 超速冷凍離心機,購于美國貝克曼庫爾特有限公司。
30只清潔級SD大鼠,體重140~160 g/只,雌(無孕)雄不拘,昆明醫(yī)學院實驗動物科提供。臨床檢查確認健康后,單籠預飼養(yǎng)3 d,自由飲水采食,編號并隨機分為Sudan I處理組(I, II, III和 IV組)和C組,每組6只。
將Sudan I與飼料按一定比例充分混勻,配制成4個不同劑量的顆粒飼料,分別飼喂Sudan I處理組:I組(265 mg/kg)、II組(530 mg/kg)、III組(795 mg/kg)和 IV組(975 mg/kg),連續(xù)飼喂10 d。C組飼以普通顆粒飼料,飼喂與處理組相同天數(shù)。
末次給藥后,大鼠禁食12 h,處死大鼠后立即剖腹,取肝剪碎(本實驗所用肝組織均為同一肝葉),采用鈣離子沉淀法制備肝微粒體,參照徐叔云等主編的《藥理實驗方法學》[10]提供的方法,用0.9 %生理鹽水(0~4 ℃)反復沖洗肝臟,吸干后稱重。取一定量的肝臟按1∶4加入0.25 mol/L蔗糖溶液制備20 %的組織勻漿,高速離心(4 ℃,12 500 r/min,25 min),取上清液置離心管,加入88 mmol/L氯化鈣溶液混勻,使其終濃度為8 mmol/L,靜置5 min,輕輕顛倒數(shù)次,離心(4 ℃,27 000 r/min,15 min),加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀,再次離心(4 ℃,27 000 r/min,15 min),棄上清液,得到的粉紅色沉淀即為微粒體,將其加入含20 %甘油的磷酸鹽緩沖液中,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以上步驟均在冰浴上進行。
處死大鼠后,摘眼球采血,血液滴入含抗凝劑的離心管中,用于檢測并分析血成分指標。
1.6.1 微粒體蛋白濃度的測定 采用BCA法測定微粒體蛋白濃度,以牛血清白蛋白為標準,嚴格按照試劑盒說明書操作,測得蛋白的含量。用公式(1)計算微粒體蛋白濃度。
蛋白濃度(g/L)=
(1)
1.6.2 CYP 450含量的測定 組織樣品用磷酸鹽緩沖液稀釋,使其蛋白濃度大約為0.5 mg/mL,將待測組織樣品中加入比色皿中。將配置好的0.1 g/mL連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)20 μl加入比色皿中混勻,靜置30 s。取出比色杯,充CO氣體40 s(速度應該緩慢,以氣泡連續(xù),液體不溢出為準)然后放回原位,1 min后測定450與490 nm處的吸光度差值。按公式(2)計算CYP 450的含量:
(2)
1.6.3 CYP 2E1、CYP 3A1酶活性的測定 甲醛標準曲線的建立:分別取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液,各加入去離子水補至1 mL,再分別加入Nash試劑1 mL,50 ℃水浴30 min,冷卻后,空白管調零,420 nm處測定OD值,以甲醛濃度為橫坐標,OD為縱坐標,求出線性回歸方程和相關系數(shù)r值。組織樣品酶活性的測定操作(表1)。
表1 試劑、待測樣品的劑量
空白管調零,420 nm處測定吸光度OD值,計算酶活性。根據(jù)標準曲線計算甲醛的濃度,酶活性按公式(3)計算。
酶活性(μmol/g/min)=
(3)
1.6.4 血液樣品的測定 采用半自動血液細胞分析儀,測定血成分。
2.1.1 甲醛標準曲線的繪制 分別取0、25、50、100、150和200 μl的0.1 mmol/L甲醛溶液,加入去離子水補至1 mL,則對應濃度分別0、2.5、5、10、15、20 μmol/L。420 nm處測定OD值,以甲醛濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,結果見表2。
從圖1顯示甲醛標準曲線,得到很好的線性關系,線性回歸方程為y=0.0231x+0.0259,相關系數(shù)R2= 0.9926。
圖1 甲醛標準曲線Fig.1 Standard curve of HCHO
2.1.2 CYP2E1、CYP3A1酶活性的變化 CYP 2E1酶在C、I, II, III和 IV組活性分別為132.17、164.5、211.67、209.00和203.67 nmol/g·min,結果顯示Sudan I處理組CYP 2E1酶活性顯著高于C組(P<0.01,P<0.05);CYP 3A1酶在C、I, II, III和 IV組活性分別為24.83、47.33、50.17、70.33和68.33 nmol/g·min,顯示CYP 3A1酶活性顯著高于C組(P<0.01,P<0.05)。且在一定得劑量范圍內,二者活性均有增長趨勢。
Sudan I處理組(I, II, III和 IV)的CYP 450含量顯著高于C組(P<0.05),且在一定得劑量范圍內,隨劑量上升而增加(表4)。
白細胞數(shù)目在Sudan I處理組(III和 IV)極顯著高于C組(P<0.01);紅細胞數(shù)目在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著低于C組(P<0.01,P<0.05)。血小板含量在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著高于C組(P<0.01,P<0.05);血紅蛋白含量在Sudan I處理組(II, III和 IV)顯著低于C組(P<0.01,P<0.05)。變化趨勢為在一定劑量范圍內,隨Sudan I劑量的增加,白細胞數(shù)目增加,紅細胞數(shù)目減少,血小板含量增加,血紅蛋白含量減少(表5)。
進入體內的Sudan I在肝臟細胞的還原酶作用下被分解生產具有強烈毒性的1-氨基-2-奈酚和苯胺,可誘導細胞內核物質的損傷,或與 DNA、RNA 形成加合物[11],會導致癌變,畸變的可能性,并且具有致敏性和遺傳毒性等潛在威脅。嚴玉霖等[12]報道, Sudan I能引起肝臟組織細胞發(fā)生脂肪變性,能顯著上調大鼠肝臟 CYP 1A1基因的表達,從而促進 Sudan I在體內代謝成有毒物質。機體發(fā)生中毒致使肝細胞及相應細胞器的損傷是無選擇性,這主要是通過肝臟CYP 450s酶系代謝產生的毒性產物,如親電子基、自由基、氧自由基等的作用引起線粒體、細胞核等生物膜脂質過氧化損傷,使膜流動性降低、通透性升高、膜酶活性改變、膜受體失活,從而破壞膜結構與功能,還會引起其他細胞器和整個細胞的變化,使細胞結構和功能破壞,失去膜的完整性[13-14]。CYP 2E1可被乙醇等化合物誘導,是參與N-亞硝胺、苯胺、鹵代烴類等多種前致癌物代謝為終致癌物的主要酶類[6]細胞色素的合成和催化活性水平可隨著接觸的環(huán)境因素而改變,導致疾病易感性的不同。如果CYP450s代謝芳香族外源化合物,那么CYP 450s表現(xiàn)為活性增強,含量增加。
表2 甲醛濃度OD值
表3 大鼠肝微粒體CYP2E1和CYP3A1的活性
注:*和**分別表示在P<0.05或P<0.01水平下達到顯著差異。下同。
Note:* and** indicated significant difference atP<0.05 orP<0.01 levels, respectively. The same as below.
表4 大鼠肝微粒體中CYP 450含量
采用酶活性的測定結果表明,Sudan I處理組CYP 450s含量明顯高于C組,CYP 2E1、CYP 3A1酶活性在Sudan I不同劑量組顯著高于C組,且隨著劑量增加而呈上升趨勢。在整個實驗過程中,Sudan I處理組與C組相比,大鼠肝微粒體CYP 450s含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性表現(xiàn)為增強。說明Sudan I影響了肝臟CYP 450s酶系統(tǒng),而CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1活性的增強影響了肝臟細胞的正常功能,導致機體肝臟的損傷。
表5 SudanⅠ對大鼠血液成分的變化
機體血液在全身進行大小循環(huán),流向各個組織器官,參與機體的新陳代謝,調節(jié)和維護機體各機能活動和內外環(huán)境的平衡,血液中的白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血小板量和血紅蛋白量最具有診斷參考價值。白細胞是動物機體防御系統(tǒng)的重要組成部分,數(shù)目增高見于急性中毒;紅細胞數(shù)目的減少見于造血發(fā)生障礙容易形成貧血;血小板量數(shù)目增高表現(xiàn)血液粘稠度增大,導致血液疾病的發(fā)生;血紅蛋白反應機體的貧血程度[9]。測定血液中白細胞數(shù)、紅細胞數(shù)、血紅蛋白及血小板量結果表明,隨著Sudan I處理劑量的增加,紅細胞數(shù)和血紅蛋白的量減少,白細胞數(shù)和血小板的量增加。顯示Sudan I可改變血液成分中紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血紅蛋白量和血小板量。暗示機體已經發(fā)生貧血和中毒。
研究結果表明Sudan I可促使肝CYP 450含量、CYP 2E1和CYP 3A1酶活性的升高,顯示Sudan I對血液細胞數(shù)量變化有影響,并破壞了血液中的血紅蛋白和血小板。在Sudan I致大鼠肝損傷的發(fā)生過程中,表明肝CYP 450、CYP 2E1和CYP 3A1發(fā)揮了重要作用,且對大鼠的造血機能產生了影響。