轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在棉花炭疽病侵染下的過敏性反應(yīng)檢測及相關(guān)抗性基因表達(dá)研究

劉文波，何其光，蔡加挺，靳鵬飛，林春花，鄔國良，繆衛(wèi)國

(海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 海口 570228)

【研究意義】棉花炭疽病是由棉刺盤孢菌(ColletotrichumgossypiiSoutllw.)引起的一種世界性的真菌病害。在低溫，多雨潮濕的環(huán)境下，幼苗的發(fā)病率可以高達(dá)47.08 %[1]。在棉花中后期可引起葉片脫落，導(dǎo)致產(chǎn)量及品質(zhì)下降。選育和推廣抗病品種是防治棉花炭疽病的最有效，最經(jīng)濟(jì)的途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Hapin蛋白是由hrp基因編碼并通過Ⅲ型分泌通道泌出的，在非寄主植物上激發(fā)過敏性反應(yīng)，并能夠誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)抗性的一類蛋白激發(fā)子[2]。Harpin蛋白首次從梨火疫病菌(Erwiniaamylovora) 中分離。Hapin蛋白具有豐富的有益生物活性，可以通過不同的信號通路誘導(dǎo)多種植物抗病、抗蟲和抗旱，還能促進(jìn)植物生長[2-3]。國內(nèi)外已有用編碼Harpin的hrp基因轉(zhuǎn)入到煙草[4-7]、馬鈴薯[8]、蘋果[9]、梨[10]、甜菜[4]、小麥[11]、水稻[12-13]和棉花[14]等植物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對Ralstoniasolanacearum、Alternariaalternata、E.amylovora、Phytophthorainfestans、Botrytiscinerea、Fusariumoxysporum、F.graminearum、Xanthomonasoryzaepv.oryzae、Magnaporthegrisea、Verticilliumdahliae和煙草花葉病毒TMV等多種病原菌產(chǎn)生了較好的抗性，并促進(jìn)了植物相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)，但他們的防衛(wèi)基因表達(dá)不盡相同[7,15-16]。研究表明，Harpin蛋白能激活植物中水楊酸(salicylic acid，SA)介導(dǎo)的途徑，使植物獲得系統(tǒng)抗性，從而增強(qiáng)植物對病原菌的抗性[17]。此外，Harpin蛋白還能誘導(dǎo)植物信號傳導(dǎo)鏈中的信號分子，引起植物的防衛(wèi)反應(yīng)[18]；在轉(zhuǎn)hpa1Xoo基因的棉花中，接種黃萎病菌24 h后葉片組織中有活性氧顯著積累，PAL(苯丙氨酸解氨酶)和POD(過氧化物酶)活性顯著增強(qiáng)[19]；Harpin蛋白噴施煙草葉片后，PAL、POD和PPO(多酚氧化酶)活性都有不同程度的增強(qiáng)[20]，可以激發(fā)煙草過敏性細(xì)胞壞死(hypersensitive cell death， HCD)[21]，還能增強(qiáng)植物的基本防衛(wèi)功能[22]。轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花能夠增強(qiáng)棉花對多種病害的抗性[19,23]，但沒有抗棉花炭疽病的相關(guān)報(bào)道。近年來由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)賦予不同種類植物新的農(nóng)藝性狀，使植物在抗病性和品質(zhì)等方面得到了改善。直到2009年大約有100種外源基因轉(zhuǎn)入棉花中[16]，但至今仍未見有轉(zhuǎn)hrp基因棉花抗棉花炭疽病的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文通過比較轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花與普通棉花對棉花炭疽病的抗性進(jìn)行評價(jià)，探索轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花的應(yīng)用潛力?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為培育抗炭疽病棉花材料提供可能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陸地棉品系854，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花的遺傳穩(wěn)定后代株系(出發(fā)品種是陸地棉品系854)，棉花炭疽病菌(HNNC8)，均由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院分子植病實(shí)驗(yàn)室提供。

試劑: 過氧化氫測試盒(南京建成生物工程研究所)、DAB顯色試劑盒(南京建成生物工程研究所)、0.01 mol/LPBS緩沖液pH 7.2～7.4 (Solarbio)、96 % 乙醇、愈創(chuàng)木芬、30 % H2O2、0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液、β-巰基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、0.02 mol/L苯丙氨酸溶液(3.3 g·L-Phe溶于1000 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液中)、0.1 mol/L pH 6.0硼酸緩沖液(pH 8.8,含0.39 g/L巰基乙醇)、RNAprep Pure Plant Kit(TIANGN)、SYBR?Premix ExTaqTM ‖(TliRNaseH Plus)(TaKaRa)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Themo)、DL2000 DNA Marker(TaKaRa)、2×EcoTaqPCR SuperMix(TRANS)、H2O3Dry Bath(Coyote Bioscience Company)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 將棉花炭疽病菌接種于裝有150 mL PBD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，以28 ℃、200 r/min培養(yǎng)5 d，然后雙層無菌紗布過濾，接種時(shí)孢子懸浮濃度為1.0×107個(gè)/mL。

1.2.2 接種方法 為防止自然病原的侵染，實(shí)驗(yàn)在隔離的恒溫恒濕的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，并對將要接種植株的新梢，在抽芽時(shí)進(jìn)行套袋隔離。用注射器針頭輕刺棉花葉片(分別在正面主葉脈兩側(cè)，圓形面積約0.5 cm2的地方針刺15～20個(gè)點(diǎn)，盡量不要將葉片刺穿)[24]，將分生孢子懸浮液均勻噴灑在葉片的正反兩側(cè)，0、12、24、48、72 h，5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取2片轉(zhuǎn)基因棉花葉片，一株共取10片，以陸地棉品系854為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 棉花體內(nèi)H2O2含量測定 分別選擇接種棉花炭疽菌后0、12、24、48、72 h轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和對照棉花的葉片，用直徑為1.0 cm的打孔器把每個(gè)處理分別打3張葉片，每個(gè)葉片分別打取1.0 cm3個(gè)小圓片。使用H2O2測定試劑盒(南京建成)定量測定H2O2的含量。將上述處理過的轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花葉片和對照棉花葉片，分別加入1 mL PBS緩沖液(pH 7.3)，研碎成汁，5000 r/min離心5 min，取上清液，測定H2O2與鉬酸絡(luò)合物在405 nm處的OD值。主要參數(shù)如表1所示。

表1 棉花葉片組織內(nèi)H2O2含量測定主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1.2.4 葉片H2O2的定位檢測 小心用直徑為1.0 cm的打孔器分別在每個(gè)處理時(shí)段打取3張棉花葉片，每個(gè)葉片打取3個(gè)1.0 cm的小圓片，放入3,3-二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzine,DAB)染液中(試劑A︰試劑B=1︰19)，25 ℃光下染色8 h；除去染色液后，加入96 %乙醇脫色至葉片由綠變半透明；水懸浮，鏡檢，拍照。

1.2.5 POD(過氧化物酶)活性測定 供試植株接種后第0、12、24、48、72小時(shí)分別提取噴菌的棉花葉片0.2 g，放入研缽中，加入適當(dāng)液氮粉碎后加入1 mL pH 5.5的0.05 mol/L的PBS緩沖液混勻，轉(zhuǎn)至離心管中，3000 r/min離心10 min,上清液即為酶粗提液；在50 mL 100 mmol/L 的PBS緩沖液中加入28 μl愈創(chuàng)木芬，溶解冷卻后加入19 mL 30 % H2O2作為POD反應(yīng)液；取0.5 mL酶粗提液，2 mL POD反應(yīng)液與1 mL 0.2 mol/L 磷酸二氫鉀反應(yīng)，每隔1 min測其A470，以ΔA470/Δt=0.01 min-1表示一個(gè)酶活力單位(U)[19]。

1.2.6 PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性測定 供試植株接種后第0、12、24、48、72小時(shí)分別提取涂菌的棉花葉片0.2 g，加含5 mmol/L的巰基乙醇硼酸緩沖液，0.05 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，冰浴研磨，4℃，10 000 r/min離心15 min，上清液即為酶粗提液；加1 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸，2 mL蒸餾水，總體積為4 mL，對照加1 mL蒸餾水，置30 ℃恒溫水浴鍋30 min，290 nm處測OD值，以每小時(shí)在290 nm處吸光度變化的0.01所需酶量為1單位[25]。

1.2.7 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄以及qRT-PCR檢測 ①RNA的提取。選用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN)試驗(yàn)操作方法，提取供試的2種棉花樣品的總RNA。②反轉(zhuǎn)錄。以提取到的RNA為模板，采用TaKaRaPrimeScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒提供的方法合成cDNA。③防衛(wèi)相關(guān)基因的檢測。用不同處理的棉花葉片cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以陸地棉品系854葉片cDNA作為陽性對照，選取在真核生物中高度保守且為組成性表達(dá)的基因EF-1α為內(nèi)參基因，檢測基因分別有PR-1b、hsr203J、NPR-1。所用引物及其檢測參數(shù)見表2。

表2 檢測引物序列及參數(shù)

注：按照Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System的操作方法進(jìn)行試驗(yàn)。

Notes: Test according to the operating method of Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System.

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析均采用 SAS (9.1)軟件和 Excel(2010)軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種棉花炭疽病菌后轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生H2O2的變化

為了更好探討活性氧在細(xì)胞內(nèi)引起的非特異性反應(yīng)，觀察接菌后0～72 h內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花及出發(fā)品種棉花葉組織中H2O2含量變化。由圖1可見，出發(fā)品種棉花只有在24 h時(shí)略微有上升，且整體漲幅較小，隨后H2O2的含量又下降到初始水平；轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在12 h內(nèi)H2O2的含量略微下降，但在48 h時(shí)H2O2顯著增加，達(dá)到5個(gè)測定時(shí)間點(diǎn)的峰值，隨后在72 h時(shí)H2O2的含量下降到初始水平。但出發(fā)品種棉花葉片在24 h達(dá)到峰值，總體的H2O2積累低于轉(zhuǎn)基因品種，表明轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花葉組織的H2O2積累水平超過了出發(fā)品種。

2.2 H2O2顯微定位檢測

氧化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)能與H2O2結(jié)合形成紅褐色沉淀，可定位H2O2酶活性的位置。植物體內(nèi)的氧爆發(fā)是植物受外源物質(zhì)刺激引起的最早事件之一，其特點(diǎn)就是植物體內(nèi)H2O2的積累。為檢測轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花受棉花炭疽的侵染是否伴有H2O2信號分子的積累，選擇DAB染色法進(jìn)行H2O2顯微定位檢測。分別在接菌后0、12、 24、48、72 h 5個(gè)時(shí)段用顯微觀察轉(zhuǎn)基因棉花和非轉(zhuǎn)基因棉花品種陸地棉品系854，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DAB染液染色后的棉花葉片組織均有不同程度的褐色沉淀存在(圖2)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)hpalXoo棉花葉片上H2O2在0、12、24、48 h有逐漸增長的趨勢；24、48、72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅褐色沉淀比之前兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯增多；但在48 h達(dá)到峰值，在72 h又有下降的趨勢。普通棉花品種陸地棉品系854則沒有這種明顯的變化趨勢。此外，接菌到72 h時(shí)轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和出發(fā)品種棉花葉片里DAB染色程度相當(dāng)，但其它時(shí)間點(diǎn)均多于普通棉花。這說明轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在接菌后逐漸積累更多的H2O2，在48 h左右產(chǎn)生量達(dá)到峰值，從而對棉花炭疽菌的抗性最強(qiáng)。與顯微觀察到的結(jié)果相吻合。

圖1 接種棉花炭疽病菌后轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和陸地棉品系854葉組織中H2O2含量的變化(n=4, x±SD)Fig.1 H2O2 content of transgenic hpalXoo cotton and Simian 3 leaves inoculated via pin-puncturing method with C.gossypii Soutthw.

2.3 相關(guān)酶活性檢測

本實(shí)驗(yàn)在測定0、12、 24、48、72 h內(nèi)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)棉花葉片中過氧化氫的含量及其位置的同時(shí)，也測定了轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和出發(fā)品種棉花葉片中POD和PAL 2種酶的活性。

A、B、C、D、E分別是CK：0、12、24、48、72 h; F、G、H、I、J分別是T: 0、12、24、48、72 h圖2 接種棉花炭疽菌后轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花(T)和陸地棉品系854(CK)葉組織中H2O2檢測Fig.2 Detection of H2O2 in transgenic hpalXoo cotton and Gossypium hirsutum leaves inoculated with C. gossypii Soutthw

圖3 接種棉花炭疽病菌后轉(zhuǎn)基因棉花和陸地棉品系854葉組織中POD(A)和PAL(B)活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 POD(A) and PAL(B) activities of the transgenic hpalXoo cotton and Simian 3 leaf tissues inoculated by C.gossypii Soutthw

植物細(xì)胞內(nèi)存在的POD可以催化分解H2O2生成H2O和O2，并可使脂肪酸、芳香胺和酚類等化合物氧化。之前有外文文獻(xiàn)報(bào)道POD酶活性升高是植物抗病性的一種表現(xiàn)形式[26]。轉(zhuǎn)基因棉花品系在棉花炭疽菌侵染后葉片內(nèi)的POD酶活性在12 h出現(xiàn)一個(gè)峰，隨后又下降，但在72 h又有一個(gè)峰值，而且這個(gè)峰比前面12 h的峰更高；普通棉花葉片的POD活性升高非常緩慢[圖3(A)]。這就說明了轉(zhuǎn)基因棉花比出發(fā)品系的棉花對棉花炭疽菌有更快的應(yīng)答反應(yīng)。

POD和PAL活性增加是局部和系統(tǒng)抗病性的重要組成部分，而PAL是植物中苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵性限速酶，在植物的抗病反應(yīng)中起著非常重要的作用[27]。苯丙氨酸類代謝是形成多種具有抗菌作用的產(chǎn)物之一，比如酚類、木質(zhì)素等化合物，它們催化苯丙氨酸類的脫氨反應(yīng)，釋放出NH3，形成反式肉桂酸[25]。轉(zhuǎn)基因品系在接種炭疽菌后PAL活性有較大的升高。在病原菌侵染后，轉(zhuǎn)基因棉花中在12 h雖低于出發(fā)品種，但差異不顯著，到接菌后24 h，轉(zhuǎn)基因棉花和普通棉花品系葉組織中PAL活性都上升，其中出發(fā)品種棉花達(dá)到5個(gè)測量時(shí)間點(diǎn)的最高點(diǎn)，但轉(zhuǎn)基因品系在48 h才達(dá)到最高點(diǎn)，此時(shí)酶活性最高，而且轉(zhuǎn)基因棉花葉組織中PAL活性高于出發(fā)品種[圖3(B)]。

2.4 防衛(wèi)相關(guān)hsr203J、NPR1和PR-1b基因的時(shí)序性表達(dá)

EF-1α作為內(nèi)參基因，比較不同時(shí)間點(diǎn)過敏性反應(yīng)(hypersensitive response，HR)的標(biāo)志基因hsr203J，防衛(wèi)反應(yīng)標(biāo)志基因NPR1、PR-1b的表達(dá)情況(圖4)。

HR標(biāo)志基因hsr203J的表達(dá)情況：在0 h，病原菌還沒有侵入植物組織細(xì)胞，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在0 h表達(dá)比普通棉花低，但在12 h表達(dá)量明顯提高，和普通品種的表達(dá)量相當(dāng)，并且在24 h表達(dá)高于普通棉，這說明在這一時(shí)間段，由于病原菌的侵染激發(fā)了植物細(xì)胞的過敏壞死反應(yīng)。到48 h，植物細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)使病原菌數(shù)量下降，所需的HR程度降低，所以轉(zhuǎn)基因棉的表達(dá)又與普通棉持平，直至到72 h轉(zhuǎn)基因棉幾乎沒有表達(dá)(圖4 A)。

防衛(wèi)反應(yīng)基因NPR1的表達(dá)：在0 h時(shí)，NPR1基因在轉(zhuǎn)基因棉花的表達(dá)很微弱，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于該基因在出發(fā)品系的表達(dá)，在0～48 h時(shí)，該基因在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)一直低于在出發(fā)棉花的表達(dá)，在48 h的表達(dá)量雖仍低于普通植株，但相對于24 h，增加較快，直至72 h時(shí)，該基因在轉(zhuǎn)基因品系的表達(dá)與在陸地棉品系854里的表達(dá)相同(圖4 B)。

圖4 防衛(wèi)基因qPCR檢測結(jié)果Fig.4 Quantitative real-time PCR of the relevant genes expression

防衛(wèi)反應(yīng)基因PR-1b的表達(dá)：病原菌前期剛侵染0～12 h時(shí)，轉(zhuǎn)基因棉花就有表達(dá)，但相對較弱，而在24～48 h時(shí)，侵染量較多強(qiáng)度較強(qiáng)所以PR-1b基因表達(dá)量處于較高水平，48～72 h開始減弱，72 h時(shí)轉(zhuǎn)基因棉花的表達(dá)類似于普通棉花的表達(dá)，表達(dá)水平較低(圖4 C)。

3 討 論

氧爆發(fā)是植物抗病的重要表現(xiàn)，而氧爆發(fā)主要表現(xiàn)是H2O2等ROS(reactive oxygen species)的突增[28]。轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在對棉花黃萎病和棉花枯萎病的抗性研究中發(fā)現(xiàn)H2O2的積累量在前面幾個(gè)小時(shí)內(nèi)先出現(xiàn)一個(gè)較小的峰，下降后又會(huì)出現(xiàn)一個(gè)更高的峰，即出現(xiàn)所謂的“雙峰現(xiàn)象”[19]。但是在本實(shí)驗(yàn)中筆者只觀察到H2O2含量的變化趨勢呈現(xiàn)“單峰”，這與之前的文獻(xiàn)記載有所不同[29-30]。一方面可能是在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)所選取的各時(shí)間點(diǎn)間隔太大，而導(dǎo)致無法及時(shí)捕捉到H2O2的變化，從而導(dǎo)致不能觀察到H2O2含量的“雙峰”變化趨勢；另一方面可能是棉花植株對于炭疽菌的防衛(wèi)反應(yīng)方式不同于棉花對枯萎病和黃萎病。H2O2的定位檢測中，抗病性較強(qiáng)的品種比普通植株的紅褐色沉淀出現(xiàn)時(shí)間早，而且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的沉淀量多于普通對照組[31]。在本實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花在48 h的紅褐色沉淀最多且明顯，對比各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和陸地棉品系854 2個(gè)材料，結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉花的紅褐色沉淀多于陸地棉品系854的沉淀。但是在普通棉花陸地棉品系854卻發(fā)現(xiàn)在12 h可以比較發(fā)現(xiàn)紅褐色沉淀增加，而且在24 和48 h 2個(gè)時(shí)間點(diǎn)染色情況幾乎相同。但是，測量H2O2含量及其定位檢測兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，捕捉到了在接種炭疽菌后H2O2在棉花植株體內(nèi)的表達(dá)存在時(shí)序性變化?？梢哉f明由于棉花炭疽菌的侵染，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花的HR反應(yīng)比陸地棉品系854的HR產(chǎn)生的時(shí)間早且強(qiáng)度大。

面對病原菌的侵入，抗病植物會(huì)通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生氧迸發(fā)(過氧化氫、氧自由基等)，但是，這些活性氧的量過多，會(huì)對植物細(xì)胞造成損傷，因此要及時(shí)清除這些多余的ROS[32-33]。王金華等人在研究轉(zhuǎn)GO基因番茄的抗病機(jī)制中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄株系的POD活性比非轉(zhuǎn)基因番茄明顯增加，且轉(zhuǎn)基因番茄的活性高峰出現(xiàn)時(shí)間早，另外，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄接種后PAL活性出現(xiàn)2個(gè)活性高峰，但對照組的番茄只有一個(gè)出現(xiàn)較遲且較低的高峰[25]，曹賜生等人在研究白葉枯病菌對雜交水稻苗的影響中也發(fā)現(xiàn)了PAL活性的類似現(xiàn)象[34]。本研究中，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花的POD也出現(xiàn)了2個(gè)活性高峰，并且比陸地棉品系854的POD活性高，但是在24 和48 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花和出發(fā)品種棉花的POD活性幾乎沒有差異。導(dǎo)致這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的特殊性，可能是由于前期病菌的侵染而引發(fā)了植物的第一輪防衛(wèi)反應(yīng)，病原菌被抑制，從而使得ROS含量下降繼而不需要高活性的POD。另外，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花的PAL活性在病原菌侵入前期時(shí)反而低于陸地棉品系854葉片內(nèi)的PAL活性，但是隨后轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花的PAL活性迅速增加，并且一直明顯高于出發(fā)品種陸地棉品系854的PAL活性。而陸地棉品系854的PAL只有在24 h達(dá)到測量時(shí)間點(diǎn)的高峰，隨后活性一直下降。轉(zhuǎn)hpalXoo基因品系這兩種酶的活性都存在著時(shí)序性變化差異，并且在病菌侵染的某一階段酶的活性顯著高于陸地棉品系854的酶的活性，這說明了在轉(zhuǎn)基因棉花葉片內(nèi)的ROS較多，需要更多的酶去清除而維持內(nèi)環(huán)境平衡。

大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb．)侵染轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花，引發(fā)的氧爆發(fā)發(fā)生在HR之前[19]；HR標(biāo)志基因hsr203J的表達(dá)，與清除酶活性的變化是氧迸發(fā)和HR關(guān)聯(lián)的進(jìn)一步證據(jù)[35]。檢測這些防衛(wèi)基因涉及通過SA、JA(Jasmonic acid，茉莉酸)，或乙烯介導(dǎo)的植物基礎(chǔ)防衛(wèi)途徑[36]。熒光定量PCR檢測了轉(zhuǎn)hpalXoo煙草的植物過敏性反應(yīng)標(biāo)志基因hsr203J，Harpinxoo蛋白激發(fā)煙草葉片產(chǎn)生過敏性反應(yīng)(HR)，hsr203J基因上調(diào)表達(dá)[16, 37]。當(dāng)棉花炭疽菌侵染轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花時(shí)，harpinxoo在棉花體內(nèi)的表達(dá)增強(qiáng)了棉花體內(nèi)的H2O2積累水平，隨即微過敏產(chǎn)生，hsr203J基因超表達(dá)。因此，當(dāng)轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花受到炭疽菌侵染時(shí)，賦予了轉(zhuǎn)基因棉花對病原菌的抗性；我們同時(shí)檢測了NPR1、PR-1b基因的表達(dá)情況，不同時(shí)段的表達(dá)量不同，但在處理24 h時(shí)，都保持了相對較高的表達(dá)量，這可能與harpinxoo激活了不同的防衛(wèi)通路有關(guān)[16]。但是hsr203J、NPR1、PR-1b基因的表達(dá)在不同的侵染時(shí)段能檢測出來，而且都存在著時(shí)序性表達(dá)差異，也能說明轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花對棉花炭疽菌的抗性增強(qiáng)。通過對H2O2含量檢測與定位，POD和PAL 2種酶活性變化檢測，相關(guān)防衛(wèi)基因的時(shí)序性表達(dá)等結(jié)果分析得出，轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花對棉花炭疽菌的抗性明顯增強(qiáng)。至此可以初步確定hpalXoo基因確實(shí)能夠增強(qiáng)非寄主植物對炭疽病的抗性。

4 結(jié) 論

本研究通過熒光定量PCR方法，檢測3個(gè)防衛(wèi)相關(guān)基因hsr203J、NPR1和PR-1b在轉(zhuǎn)hpalXoo基因棉花被棉花炭疽菌處理后的表達(dá)情況，結(jié)果顯示hsr203J、NPR1和PR-1b基因均上調(diào)表達(dá)。表明病原菌侵染能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因棉花不同信號通路(至少包括由SA介導(dǎo)的途徑)的啟動(dòng)，產(chǎn)生相關(guān)抗性蛋白，從而使植株獲得抗病性。因而，轉(zhuǎn)hpalxoo基因棉花可能為某些防衛(wèi)基因超水平表達(dá)提供了分子基礎(chǔ)。