氧化苦參堿對胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及Gli2表達影響

劉百慶，張 斌，許 威，張文成，夏時海

(中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心 肝膽胰脾中心，天津 300162)

胰腺癌是一種難治性疾病，與其早期轉(zhuǎn)移且診斷困難而延誤治療時機有很大關(guān)系，因而研發(fā)針對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物具有重要的臨床價值。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機制，它是指上皮細胞失去極性、細胞間接觸轉(zhuǎn)變成間質(zhì)樣細胞的過程，伴隨細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的大量產(chǎn)生，從而促進細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[1-2]。在胰腺癌患者中，絕大部分為胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)。大量研究證實，EMT在PDAC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。Panc-1細胞是一種常見的用于研究PDAC生物學特性的低分化胰腺癌細胞株，并且，常見的EMT誘導因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF β1)可通過激活hedgehog等信號通路誘導panc-1細胞構(gòu)建EMT模型[3-5]。已有大量的藥物研究用于對抗胰腺癌的EMT從而抑制癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移[3,5]。氧化苦參堿(oxymatrine,OM)為中藥苦參干燥根中提取的生物堿，具有廣泛的抗腫瘤作用，可抑制胰腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[6-8]。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，OM可以抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其機制與OM可抑制EMT有關(guān)[9-10]。然而，OM對胰腺癌panc-1細胞EMT是否有抑制作用及其機制仍不清楚?；谏鲜鲅芯?，我們在TGF β1誘導panc-1細胞構(gòu)建EMT模型的基礎(chǔ)上，利用OM進行干預，檢測EMT相關(guān)因子的表達變化；同時檢測hedgehog信號通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2的表達變化，初步探討OM對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其可能機制，為研發(fā)抗癌藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺導管癌細胞株panc-1購自中科院上海生科院細胞資源中心；高糖DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶公司；OM購自英國Abcam公司；TGF β1購自美國Sigma公司；Transwell小室購自美國Millipore公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；蛋白Marker購自北京索萊寶公司；RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京鼎國昌盛公司；PVDF膜購自美國BD公司；單克隆兔抗人E-cadherin、兔抗人Vimentin、兔抗人Snail1、兔抗人Twist1和兔抗人GAPDH 購自沈陽萬類公司；兔抗人Gli2購自武漢三鷹公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG二抗購自北京鼎國昌盛公司；ECL發(fā)光液購自上海碧云天公司；垂直板電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽購自美國Bio-Rad公司；5200Multi自動熒光/化學發(fā)光成像儀購自上海天能科技有限公司；ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Panc-1細胞用含10%FBS、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的孵育箱中。取對數(shù)生長期細胞隨機分為4組：對照組(Control組)、模型組(TGF β1∶10 ng/mL)[3-5]、OM治療組 (TGF β1 10 ng/mL+OM 1 mg/mL)[7-8,11]、OM對照組(OM:1 mg/mL)。待細胞增至70%～80%接觸率時用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基饑餓4 h后加入OM，作用0.5 h后再加入TGF β1，OM作用24 h，TGF β1作用48 h后終止培養(yǎng)。每組實驗重復3次。

1.2.2 Transwell法測細胞侵襲力 取對數(shù)生長期的panc-1細胞計數(shù)，用不含血清的DMEM培養(yǎng)基配成2.5×105/mL的細胞懸液；在24孔板中加入500 μL含血清的DMEM培養(yǎng)基，而后將提前涂過Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室放入其中，每個小室上室加入配制好的細胞懸液200 μL，周圍孔用D-Hank’s緩沖液填充；設(shè)如上4組，37 ℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)48 h；而后取出小室， PBS緩沖液清洗3次后分別以4%多聚甲醛固定20 min、0.1%結(jié)晶紫染液染色15 min；用棉簽除掉上室面細胞，顯微鏡下觀察各組穿透到下室面的細胞數(shù)量。每組實驗重復3次。

1.2.3 Western blot檢測EMT相關(guān)蛋白及Gli2表達 超聲裂解法提取各組panc-1細胞總蛋白，BCA法測定濃度后電泳分離，條件為恒壓80 V、30 min之后調(diào)至120 V至分離完畢，樣品量20 μg；電泳結(jié)束后以90 V恒壓90 min冰浴下將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將目的蛋白條帶置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中封閉3 h；加入相應的一抗稀釋液(E-cadherin、Twist1、Gli2稀釋度為1∶500，Vimentin、Snail1、GAPDH稀釋度為1∶1 000)，4 ℃條件下孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗稀釋液(稀釋度1∶10 000)室溫中孵育3 h，再次以TBST洗膜，ECL化學發(fā)光顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參，Image J軟件測取條帶灰度值進行統(tǒng)計，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。多組間比較用單因素方差分析，兩組比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OM對panc-1細胞侵襲力影響 為研究OM對胰腺癌panc-1細胞侵襲力影響，首先以TGF β1誘導panc-1細胞構(gòu)建EMT模型。如圖1所示，與對照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細胞后，侵襲到小室下室面細胞數(shù)量明顯增加；OM(1 mg/mL)干預后，細胞數(shù)量減少；單獨以O(shè)M刺激panc-1細胞，與對照組相比細胞數(shù)量無明顯改變。上述結(jié)果表明OM可能是通過抑制EMT發(fā)生抑制了panc-1細胞的侵襲。

與對照組相比，*:P<0.05；與TGF β1組相比，#： P<0.05。圖1 OM對panc-1細胞侵襲力影響

2.2 OM對TGF β1刺激的panc-1細胞中EMT相關(guān)蛋白表達影響 與對照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細胞后，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Twist1表達上調(diào)；同時，上皮標志物E-cadherin表達下調(diào)，間質(zhì)標志物vimentin表達上調(diào)。OM(1 mg/mL)干預后，上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。單獨的OM對EMT相關(guān)蛋白表達無影響(見圖2)。

與對照組相比，*:P<0.05；與TGF β1組相比，#: P<0.05。圖2 OM對TGF β1刺激的panc-1細胞中EMT相關(guān)蛋白表達影響

2.3 OM對TGF β1刺激的panc-1細胞中Gli2表達影響 與對照組相比，TGF β1(10 ng/mL)刺激panc-1細胞后，hedgehog信號通路核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2表達上調(diào)。OM(1 mg/mL)干預后，上述結(jié)果被逆轉(zhuǎn)。單獨的OM對Gli2蛋白表達無影響(見圖3)。

與對照組相比，*：P<0.05；與TGF β1組相比，#： P<0.05。圖3 OM對TGF β1刺激的panc-1細胞中Gli2蛋白表達影響

3 討論

胰腺癌是惡性程度極高的惡性腫瘤之一，被稱為“癌中之王”。在我國，其死亡率位于消化系統(tǒng)惡性腫瘤死亡的第4位，近年來發(fā)病率有明顯增高的趨勢。美國癌癥協(xié)會調(diào)查表明，胰腺癌死亡率正以每年0.3%的速度增加，5年生存率僅為6%～8%[12]。根治性的手術(shù)治療是最有效的治療方式之一，然而胰腺癌早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，約80%患者就診時轉(zhuǎn)移已發(fā)生，尸檢中更是發(fā)現(xiàn)約90%患者都存在遠處轉(zhuǎn)移[1,13]，因而研究胰腺癌的轉(zhuǎn)移機制、研發(fā)有效的抗轉(zhuǎn)移藥物對于延長胰腺癌患者的生存周期有著重要的意義。

EMT是胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要機制之一，大量的研究已經(jīng)證實胰腺癌細胞在多種信號通路、microRNAs等的調(diào)節(jié)下，通過啟動EMT導致上皮細胞間連接的關(guān)鍵蛋白E-cadherin、ZO-1表達減少，同時細胞獲得極性，使遷移侵襲能力得到增強[1-5]。TGF β1是常用的EMT誘導因子，可誘導PDAC細胞株panc-1構(gòu)建EMT模型[3-5]。我們的實驗中，10 ng/mL的TGF β1刺激panc-1細胞48 h后，細胞侵襲力得到明顯增強；同時，Western blot結(jié)果表現(xiàn)為EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1 、Twist1及間質(zhì)標志蛋白vimentin表達上調(diào)而上皮標志蛋白E-Cadherin表達下調(diào)，說明EMT模型建立成功。在此基礎(chǔ)上，我們探討了OM對胰腺癌EMT的作用。OM是課題組前期一直研究的一種中藥提取物，具有廣泛的生物學作用，包括抗癌和抗纖維化等，但具體機制尚未研究清楚[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，OM可以抑制胰腺癌SW1990細胞的侵襲力，但其與EMT之間的關(guān)系還不清楚[8]。除胰腺癌之外，OM還可以抑制其他腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[6,15-17]，特別是OM可以通過抑制EMT進而抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移[9-10]。在其他方面，有研究發(fā)現(xiàn)OM可以通過抑制EMT進而抑制胰腺、肺、腎等器官的纖維化[18-20]，提示OM對EMT具有抑制作用。本實驗中，OM作用于TGF β1刺激的panc-1細胞后，細胞增強的侵襲力得到抑制；同時，EMT相關(guān)標志蛋白的表達被逆轉(zhuǎn)，提示OM對胰腺癌EMT具有抑制作用。然而，單獨使用1 mg/mL的OM對panc-1細胞的侵襲力及EMT相關(guān)蛋白表達的影響并不明顯，其原因可能與panc-1細胞分化程度低、OM作用濃度及時間不足等有關(guān)，有待進一步研究。上述研究結(jié)果表明，OM可能日后作為單一或聯(lián)合其他化療藥物用于胰腺癌的臨床治療。

最后，我們初步探討了一下OM抑制胰腺癌panc-1細胞EMT的可能機制。多種信號通路都可參與調(diào)節(jié)TGF β1誘導的胰腺癌EMT過程。馬笛等[21]在研究大蒜素對TGF β1誘導的胰腺癌EMT抑制作用中發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路可能參與了panc-1細胞EMT的發(fā)生。此外，TGF β1/Smad、Akt/mTOR、MAPK、hedgehog等信號通路也參與了TGF β1誘導的胰腺癌EMT發(fā)生[22-25]。另一方面，Jun二聚化蛋白2(Jun dimerization protein 2,JDP2)、Rac1b、DNA甲基化結(jié)合蛋白3 (Methyl-CpG-binding domain 3,MBD 3)等蛋白還可通過負向調(diào)節(jié)MAPK、TGF-β/Smad等信號通路進而抑制TGF β1誘導的胰腺癌EMT發(fā)生[26-28]。此外，研究發(fā)現(xiàn)OM也可以通過抑制TGF β1/Smad、NF-κB等信號通路抑制腫瘤細胞的EMT過程[9-10]。值得關(guān)注的是，hedgehog信號通路廣泛參與了胰腺癌EMT過程。Gli蛋白家族是hedgehog信號通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子，其中，Gli1、Gli2均有轉(zhuǎn)錄激活作用，在胰腺癌EMT過程中發(fā)揮重要作用[4,29]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF β1誘導胰腺癌細胞后通過募集Smad3結(jié)合到Gli2的啟動子區(qū)誘導Gli2的表達，后者表達又可進一步上調(diào)Gli1的表達[30]。并且課題組最近研究發(fā)現(xiàn)，OM可抑制TGF β1誘導的panc-1細胞中Smad3/Gli1的表達[31]。然而，OM對Gli2是否也有抑制作用未有研究。我們的實驗中，TGF β1刺激panc-1細胞后Gli2表達上調(diào)；OM干預后，Gli2表達被抑制，結(jié)合課題組前期結(jié)果，提示OM對hedgehog信號通路具有一定的抑制作用。

綜上所述，TGF β1誘導panc-1細胞構(gòu)建EMT模型后給予OM進行干預，panc-1細胞的侵襲力及EMT相關(guān)標志物表達受到抑制；同時，OM還抑制了TGF β1刺激引起的hedgehog信號通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli2的高表達，結(jié)合研究已證實hedgehog信號通路參與調(diào)控胰腺癌的EMT過程及OM對胰腺癌細胞中高表達的Gli1亦具有抑制作用，提示OM抑制EMT進而抑制胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用可能與OM對hedgehog信號通路中核心轉(zhuǎn)錄因子Gli1/2的抑制有關(guān)，豐富了OM的抗癌機制，為今后的進一步研究和臨床應用提供參考。