香椿葉提取物對(duì)脂代謝異常大鼠視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)機(jī)制研究*

張園園，于利

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，遼寧 錦州 121001）

老年性黃斑變性（senile macular degeneration,SMD）是世界范圍內(nèi)不可逆性致盲眼病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素參與其發(fā)生、發(fā)展過程；肥胖、高脂血癥患者視網(wǎng)膜變性發(fā)病概率增加[1]。超重和肥胖可引起機(jī)體生理功能的改變，如高氧化應(yīng)激水平，炎癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因子，血脂代謝的失衡，而這些都參與SMD的發(fā)病[2]。血脂異?？墒挂暰W(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損害，Bruch膜脂質(zhì)的沉積并破壞其完整性，并導(dǎo)致脈絡(luò)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理改變[3]。而視網(wǎng)膜Brucn膜脂質(zhì)沉積又可引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及感光細(xì)胞損傷，使其功能下降，最終引起視力不可逆損傷[4]。

香椿葉是我國(guó)著名的食用藥用植物，富含多種活性物質(zhì)，具有很高的藥用價(jià)值。香椿葉提取物（toona sinensis leaf extract, TSLE）主要成分是具有抗癌、抗氧化應(yīng)激等多種生物活性功能的沒食子酸[5-7]，并且其對(duì)機(jī)體很多組織具有抗炎及調(diào)節(jié)脂代謝等功能[8-9]。本實(shí)驗(yàn)在高脂血癥大鼠視網(wǎng)膜損傷的基礎(chǔ)上，觀察TSLE對(duì)脂代謝異常引起的視網(wǎng)膜損傷是否有保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.1 模型的復(fù)制 24只雄性SD大鼠，鼠齡12周，體重（300±20）g，購自錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。所有大鼠自由飲食水，晝夜交替12 h，模型組（16只）胃飼高脂飼料（玉米面30%、膽固醇10%、豬油60%、10 ml/kg），正常組（N組，8只）給予等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間每3天稱重，觀察各組大鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)。8周后檢測(cè)血脂水平，確定模型是否復(fù)制成功。

1.1.2 藥物處理 模型復(fù)制成功后，模型組隨機(jī)分為高脂飲食組（HF組）和高脂飲食+香椿葉提取物組（HF+TSLE組），每組8只。HF+TSLE組給予香椿葉提取物（1 g/kg）水溶液灌胃，HF組給予等量生理鹽水，4周后對(duì)所有大鼠進(jìn)行閃光視網(wǎng)膜電圖（flash electroretinogram, FERG）檢測(cè)，血脂及肝指數(shù)的檢測(cè)。各組動(dòng)物取眼進(jìn)行石蠟包埋蘇木精-伊紅染色，免疫組織化學(xué)和Western blotting檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中蛋白的表達(dá)水平。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

復(fù)方托吡卡胺滴眼液（長(zhǎng)春迪瑞制藥有限公司），抗兔一抗 IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），抗兔二抗（美國(guó)Thermo公司），電生理檢測(cè)設(shè)備（重慶艾爾曦公司），自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)萊卡公司），多聚甲醛（北京化學(xué)試劑公司），DAB顯色劑（丹麥Dako Cytomation公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），蛋白電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血清血脂及肝臟指數(shù)的檢測(cè) 各組大鼠禁食水12 h，1%戊巴比妥鈉（0.5ml/kg）麻醉后心臟取血，檢測(cè)血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量；并取肝臟，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，稱肝濕重，計(jì)算肝臟指數(shù)。

1.3.2 眼視覺電生理檢查 各組大鼠FERG檢查前暗適應(yīng)12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液充分散瞳，暗室內(nèi)安放電極，記錄電極置于雙眼角膜上，羥糖苷滴眼液（alcon laboratories, Inc）保持角膜滋潤(rùn)，參考電極刺入雙耳皮下，接地電極刺入尾部，選擇合適光源及頻率刺激，記錄a波、b波潛伏期及振幅的變化。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色觀察視網(wǎng)膜形態(tài)變化 麻醉后取各組大鼠左側(cè)眼球，4%多聚甲醛中固定72 h。自動(dòng)脫水機(jī)脫水，包埋，石蠟切片（厚5 μm），脫蠟，水化，蘇木精染核，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染細(xì)胞漿，梯度脫水，中性樹脂封片，光鏡下觀察視網(wǎng)膜組織各層結(jié)構(gòu)，并測(cè)量視網(wǎng)膜厚度。

1.3.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達(dá) 選取合適石蠟切片，脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)液高溫修復(fù)抗原，3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化酶，1% Trition X-100/PBS破膜，3% BSA封閉，分別加入抗兔一抗IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3 4℃過夜，PBS清洗3次，37℃孵育二抗羊抗兔1h，DAB復(fù)染，蘇木精染核，常規(guī)脫水封片。

1.3.5 Western blotting檢測(cè)IL-6、TNF-a、NF-κB p65、Caspase-3的表達(dá) 視網(wǎng)膜組織加入適量含有蛋白酶抑制劑PMSF的裂解液，低溫離心25min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。取視網(wǎng)膜上清液、上樣緩沖液和PBS混合煮沸使蛋白變性，SDSPAGE電泳分離目標(biāo)蛋白，濕式電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，1% BSA室溫封閉1h，一抗4℃搖床過夜孵育。次日，TBST洗膜3次，羊抗兔二抗室溫孵育1h。TBST洗3次，孵育超敏發(fā)光液ECL，暗室顯影。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行校正，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，通過Shapiro-Wilk檢驗(yàn)確定為正態(tài)性分布，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體重及肝臟指數(shù)比較

N組、HF組及HF+TSLE組3組大鼠初始體重大致相同。高脂飲食喂飼后，HF組及HF+TSLE組大鼠體重增長(zhǎng)較N組增加。8周后，檢測(cè)血脂確定高脂血癥模型成功后，開始TSLE治療。治療期間，HF+TSLE組大鼠體重與HF組比較，呈緩慢增長(zhǎng)趨勢(shì)，至治療4周后，兩組大鼠體重有差異。見圖1。

圖1 3組大鼠體重增長(zhǎng)趨勢(shì)

3組大鼠肝臟指數(shù)，N組（0.032±0.002）%，HF組（0.041±0.006）%，HF+TSLE組（0.034±0.015）%，3組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.927，P=0.016）；組間兩兩比較顯示，HF組肝臟指數(shù)較N組增加（P＜0.05），HF+TSLE組肝臟指數(shù)與N組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HF+TSLE組肝臟指數(shù)較HF組降低（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠血清生化指標(biāo)比較

3組大鼠血清血脂水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；HF組與N組比較，TC、TG、LDL-C含量增高，HDL-C含量降低（P＜0.05）；HF+TSLE組TG、LDL-C、TC、HDL-C含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；HF+TSLE組與HF組比較，TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C 含量增加（P＜0.05）。見表 1。

2.3 視覺電生理檢測(cè)結(jié)果

3組大鼠a波潛伏期比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，N組與HF組比較，HF組與HF+TSLE組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組大鼠b波潛伏期、a波振幅和b波振幅比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

2.4 視網(wǎng)膜的組織形態(tài)學(xué)改變

N組視網(wǎng)膜各層組織排列緊密規(guī)則，HF組視網(wǎng)膜組織各層排列紊亂，細(xì)胞減少，尤其以外核層（ONL）和內(nèi)核層（INL）減少顯著，HF+TSLE組視網(wǎng)膜損傷狀態(tài)較HF組改善。3組大鼠視網(wǎng)膜總厚度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.567，P=0.003）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，N組和HF+TSLE組較HF組視網(wǎng)膜厚度均增加（P＜0.05）。見圖 2、3。

表1 3組大鼠血清血脂含量 （n =8，mmol/L，±s）

表1 3組大鼠血清血脂含量 （n =8，mmol/L，±s）

注：1）與N組比較，P ＜0.05；2）與HF組比較，P ＜0.05

組別 TG TC LDL-C HDL-C N 組 1.04±0.05 0.88±0.08 0.29±0.05 0.53±0.08 HF 組 1.51±0.391） 1.18±0.311） 0.39±0.061） 0.27±0.061）HF+TSLE 組 1.16±0.212） 0.80±0.052） 0.30±0.042） 0.45±0.062）F值 4.443 5.927 5.535 10.014 P值 0.036 0.016 0.020 0.001

表2 3組大鼠視網(wǎng)膜FERG a波、b波潛伏期及振幅比較 （n =8，±s）

表2 3組大鼠視網(wǎng)膜FERG a波、b波潛伏期及振幅比較 （n =8，±s）

注：1）與N組比較，P ＜0.05；2）與HF組比較，P ＜0.05

組別 a波潛伏期/ms b波潛伏期/ms a波振幅/μV b波振幅/μV N 組 14.17±2.19 40.42±5.49 37.3±16.38 129.13±40.06 HF組 19.71±1.361） 41.39±5.03 35.25±9.83 113.43±29.96 HF+TSLE組 16.17±1.802） 37.96±4.67 29.05±6.39 103.98±23.81 F值 18.053 1.392 0.839 1.893 P值 0.000 0.263 0.441 0.167

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化 （HE×400）

圖3 3組大鼠視網(wǎng)膜厚度比較 （n =8，±s）

2.5 視網(wǎng)膜組織IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，HF組IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3蛋白表達(dá)水平較N組增加，HF+TSLE組較HF組蛋白表達(dá)降低；Western blotting結(jié)果顯示，3組IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3的表達(dá)，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.290、13.770、28.340 和 10.090，P=0.017、0.031、0.011和 0.010），HF 組 IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量較N組增加（P＜0.05）；HF+TSLE組蛋白相對(duì)表達(dá)量較HF組減少（P＜0.05）。見圖 4～11。

圖4 3組大鼠視網(wǎng)膜組織IL-6表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖5 3組大鼠視網(wǎng)膜組織IL-6表達(dá) （Western blotting檢測(cè)）

圖6 3組大鼠視網(wǎng)膜組織TNF-α表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖7 3組大鼠視網(wǎng)膜組織TNF-α表達(dá) （Western blotting檢測(cè)）

圖8 3組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-κB p65表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖9 3組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-κB p65表達(dá) （Western blotting檢測(cè)）

圖10 3組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3表達(dá) （免疫組織化學(xué)×400）

圖11 3組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-3表達(dá) （Western blotting檢測(cè)）

3 討論

SMD是一種隨年齡增長(zhǎng)和慢性炎癥刺激而發(fā)展的疾病，其發(fā)生和發(fā)展與黃斑區(qū)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)混合物的沉積密切相關(guān)，沉積物的堆積最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的功能缺失或凋亡。高脂血癥時(shí)機(jī)體脂質(zhì)的代謝功能受損，長(zhǎng)期刺激，極易使視網(wǎng)膜組織遭受損失，大量中性脂質(zhì)堆積在Bruch膜，該中性脂質(zhì)的堆積最終形成玻璃膜疣，導(dǎo)致視力下降，造成不可逆的中心視力喪失[10]。目前，臨床上的治療已取得一定成效，但方法局限，因此，找到新的治療方法十分重要。

香椿葉有著悠久的食用藥用歷史，其提取物沒食子酸富含多種生物活性，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[11]，TSLE對(duì)4-羥基壬烯酸誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用以及在H2O2誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞損傷中能夠抑制促炎因子的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用[12]。

3組大鼠在高脂飲食胃飼后，血清血脂水平增加，TSLE治療后，血清血脂水平較HF組有所下降。視網(wǎng)膜光鏡下HE染色顯示高脂模型組大鼠視網(wǎng)膜變薄，各層排列紊亂，特別是外核層光感受器細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞凋亡，數(shù)量減少。而白霞等[13]也發(fā)現(xiàn)高脂引起視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的改變主要發(fā)生在外核層的感光細(xì)胞體外段視盤及視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層。TSLE治療后，視網(wǎng)膜各層組織排列較HF組大鼠視網(wǎng)膜排列相對(duì)規(guī)則，外核層細(xì)胞數(shù)量明顯增加。TSLE對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用還可通過FERG功能檢測(cè)來評(píng)估。FERG主要反映視網(wǎng)膜感光細(xì)胞到雙極細(xì)胞及無長(zhǎng)突細(xì)胞的功能。a波反映視網(wǎng)膜外層光感受器細(xì)胞層的生物電活動(dòng)，b波是對(duì)視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞電活動(dòng)的反應(yīng)，其變化能夠評(píng)價(jià)視網(wǎng)膜內(nèi)層的功能狀態(tài)。機(jī)體長(zhǎng)期代謝異常使視網(wǎng)膜組織內(nèi)外屏障受損，進(jìn)而使其轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)及代謝水平下降，而視網(wǎng)膜組織的代謝水平對(duì)感光細(xì)胞維持正常視覺是必不可少的[14]。本研究高脂干預(yù)后，HF組大鼠a波潛伏期時(shí)間較N組延長(zhǎng)，且a波振幅較N組也降低；b波潛伏期及振幅也發(fā)生改變，說明高脂對(duì)視網(wǎng)膜外層感光細(xì)胞層造成損傷，但對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)層雙極細(xì)胞的影響較小。TSLE治療后，HF+TSLE組a波b波潛伏期時(shí)間較HF組明顯縮短，視網(wǎng)膜光感受器功能得到顯著提高，但a波和b波振幅在治療后沒有增加，可能與實(shí)驗(yàn)期間電生理檢測(cè)時(shí)引起角膜損傷相關(guān)。

研究表明脂代謝異常引起體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物增多，脂質(zhì)積累，玻璃膜疣形成，進(jìn)而引起眼底慢性炎癥反應(yīng)[15]，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步使脂質(zhì)融合累積。長(zhǎng)期炎癥因子的浸潤(rùn)促使視網(wǎng)膜內(nèi)多種細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，造成視網(wǎng)膜損傷，最終使細(xì)胞凋亡，而一些炎癥因子如IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等已經(jīng)被證實(shí)可以加速SMD的進(jìn)展[16]。本研究中高脂模型大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥因子IL-6、TNF-α表達(dá)水平均升高，另外發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜組織中NF-κB p65及Caspase-3的表達(dá)也增加。NF-κB是一種多效性的核轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、分化、炎癥及凋亡反應(yīng)，p65異源二聚體是其發(fā)揮生理功能的重要結(jié)構(gòu)片段。NF-κB p65作為一種多向性調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)多種炎癥表達(dá)。IL6、TNF-α等炎癥因子的釋放、堆積誘導(dǎo)核因子NF-κB p65的激活，進(jìn)而促進(jìn)Caspase-3的表達(dá)增加，引起細(xì)胞凋亡。研究表明TSLE對(duì)多種組織有抗炎作用，其中包括TSLE對(duì)體內(nèi)體外肺損傷具有抗炎作用[17]；在NF-κB轉(zhuǎn)基因小鼠實(shí)驗(yàn)中[18]，TSLE通過調(diào)控NF-κB p65的表達(dá)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[19]，TSLE具有與非甾體抗炎藥物相同的功能作用。本研究中，TSLE對(duì)高脂模型大鼠治療后，視網(wǎng)膜組織中IL-6、TNF-α、NF-κB p65及Caspase-3的表達(dá)降低，提示TSLE對(duì)高脂大鼠視網(wǎng)膜損傷發(fā)揮保護(hù)作用可能是通過IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3信號(hào)途徑。

總之，目前的研究結(jié)果表明，TSLE是一種潛在的有效預(yù)防由于脂代謝異常的食用藥物，為SMD的預(yù)防或者治療方法提供一個(gè)新的思路。然而TSLE發(fā)揮作用的具體機(jī)制是否是通過IL-6、TNF-α、NF-κB p65、Caspase-3信號(hào)途徑仍需進(jìn)一步深入研究。