固體復(fù)合香辛料中罌粟殼質(zhì)控樣的制備

袁 磊， 李 濤， 林 芳， 王一欣， 裴小龍

(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院， 陜西 西安 710065)

隨著人們生活水平的提高，簡單的調(diào)味料已不能滿足人們的生活需求，復(fù)合香辛料在食品中的應(yīng)用越來越廣泛,由于它是由多種香辛料構(gòu)成[1]，使用方便，且在應(yīng)用時都有固定的配方，具有定量的可操作性，對于餐飲的規(guī)模化生產(chǎn)，特別在烹飪加工中菜品的質(zhì)量穩(wěn)定與標(biāo)準(zhǔn)化具有重要意義[2]。然而不法分子為了謀取利益，提高食品的口感，將罌粟殼或其浸提物添加到香辛料、調(diào)味料、火鍋料中使食物味道鮮美，罌粟殼含多種生物堿類物質(zhì)，如嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因等，長期食用易使人體產(chǎn)生依賴性而造成癮癖，導(dǎo)致慢性中毒，出現(xiàn)發(fā)冷、出虛汗、乏力、面黃肌瘦、犯困等癥狀，嚴(yán)重時可能對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成損害，引起精神失常，出現(xiàn)幻覺，有時甚至?xí)?dǎo)致呼吸停止而死亡[3-6]。截至目前，衛(wèi)計委先后公布了6批食品非法添加物質(zhì)目錄，罌粟殼被列入了第一批食品非法添加物質(zhì)目錄中[7]。

目前檢測香辛料中罌粟殼生物堿類物質(zhì)的方法有液相色譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12-13]、熒光定量PCR法[14]，國家標(biāo)準(zhǔn)方法有DB31 2010—2012《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，對罌粟殼生物堿類物質(zhì)快速檢測方法(膠體金法、電子鼻技術(shù))也有相關(guān)應(yīng)用[15-16]，然而在對生物堿類物質(zhì)的檢測過程中，基體的干擾使得在分析檢測時不能簡單地采用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來檢測校準(zhǔn)或質(zhì)量控制，需要一定帶基體的質(zhì)控樣來協(xié)助檢測才能保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性或滿足要求，目前對含有罌粟殼的香辛料質(zhì)控樣的制備技術(shù)或相近技術(shù)無公開文獻(xiàn)介紹，因此制備相關(guān)質(zhì)控樣對于檢測方法的開發(fā)、檢測過程的質(zhì)量控制、實驗室能力驗證、實驗室間比對及在快速檢測領(lǐng)域用于快檢過程質(zhì)量控制等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁、D3-嗎啡、D3-可待因?qū)φ掌?，中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，德國Merck公司；甲酸銨，色譜純，韓國Duksan公司；鹽酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉，分析純，國藥集團(tuán)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(粒度40～70 μm)、C18填料(粒徑40～50 μm)，天津博納艾杰爾公司；小茴香、八角茴香、桂皮、肉蔻、花椒、白胡椒、干姜、陳皮、丁香、孜然、甘草均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

AB Qtrap 5500型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國SCIEX公司；RWBX-08S型箱式智能微波干燥機(jī)，南京蘇瑞公司；SYH-5型三維混合儀，常州海堯干燥設(shè)備有限公司；BJ-800A型粉碎機(jī)，上海拜杰公司；IS075型直線電子加速器，同方威視公司；LYNX4000型離心機(jī)，美國Thermo公司；KQ-500DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MS3型渦旋振蕩器，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1含有罌粟殼的固體復(fù)合香辛料質(zhì)控樣的制備

本研究建立了一種含有罌粟殼的固體復(fù)合香辛料質(zhì)控樣的制備方法，制備流程見圖1，該方法簡單，可操作性強(qiáng)、質(zhì)控樣均勻性良好，穩(wěn)定性強(qiáng)，可在常溫下長期保存。

圖1 含有罌粟殼的固體復(fù)合香辛料質(zhì)控樣制備流程Fig.1 Preparation flow diagram of quality control samples of solid compound spices containing poppy shell

1.3.1.1 基質(zhì)材料的制備

根據(jù)市售香辛料、調(diào)味料的配方，取用新鮮干燥，具有本身特有氣味和無霉變的原料小茴香、八角茴香、桂皮、肉蔻、花椒(去籽)、白胡椒、干姜、陳皮、丁香、孜然、甘草，除去雜質(zhì)，進(jìn)行微波干燥，干燥時微波功率0.5 kW，1 kg物料干燥5 min。干燥后按GB 5009.3—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》檢測水分含量，使干燥后的基質(zhì)材料水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在5%以下。將干燥好的基質(zhì)材料按一定比例混合，根據(jù)市售香辛料、調(diào)味料的混合比例以及最大限度的覆蓋所有基質(zhì)材料，調(diào)整基質(zhì)材料用量及比例見表1，混合后粉碎，過40目篩，將制備好的基質(zhì)材料按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行檢驗，以確保其不含罌粟殼生物堿類物質(zhì)(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)。

表1 基質(zhì)材料用量及比例 Tab． 1 Amounts and proportions of different kinds of materials g

1.3.1.2 罌粟殼的處理

取用一定量的罌粟殼，除去雜質(zhì)后進(jìn)行微波干燥，1 kg基質(zhì)材料，微波功率0.5 kW，干燥時間為5 min。使干燥后的罌粟殼水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在5%以下，粉碎，粉碎后過40目篩，依據(jù)1.3.2節(jié)方法對制備好的材料進(jìn)行生物堿類物質(zhì)的含量檢測，檢測結(jié)果為嗎啡質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09%、可待因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.27%、蒂巴因質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.27%、罌粟堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%、那可丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%。

1.3.1.3 一次混合

根據(jù)罌粟殼中生物堿的含量，稱量3 g罌粟殼粉末，3 kg基質(zhì)材料，將m(基質(zhì)材料)與m(罌粟殼粉末)按5∶1比例進(jìn)行初次混合，混合均勻后的樣品與基質(zhì)材料m∶m=1∶10的比例再次混合，混合均勻后的樣品與剩余的基質(zhì)材料混合，根據(jù)混合后質(zhì)控樣的總量按質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的比例加入SiO2抗結(jié)劑，混合均勻。

對混合方法進(jìn)行了實驗研究，在混合時m(樣品)與m(基質(zhì)材料)的最大混合比例為1∶10，三維混合法，40 r/min，混合2 h。

1.3.1.4 二次混合

對混合均勻的質(zhì)控樣進(jìn)行二次干燥，使干燥后的基體粉末水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在5%以下，干燥后過40目篩，進(jìn)行二次混合，三維混合法，40 r/min，混合2 h。

1.3.1.5 分裝

西林瓶充氮包裝，每瓶裝10 g，共200瓶。

1.3.1.6 殺菌

采用輻照殺菌法對樣品進(jìn)行殺菌，殺菌條件為：輻照源60Co，輻照劑量7 kGy。

1.3.2質(zhì)控樣中生物堿類物質(zhì)的檢測

1.3.2.1 樣品前處理方法

按照DB 31 2010—2012方法檢測生物堿類物質(zhì)。采用0.1 mol/L鹽酸溶液與乙腈超聲提取，加入無水硫酸鎂與無水醋酸鈉離心分層，上清液經(jīng)PSA、無水硫酸鎂、C18粉末凈化后，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標(biāo)法定量，嗎啡、可待因采用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.2.2 液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)型色譜柱，柱溫35 ℃，流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動相A為甲醇，流動相B為含體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫時間6 min,梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫條件

1.3.2.3 質(zhì)譜條件

電離模式ESI+,掃描方式MRM多反應(yīng)監(jiān)測,毛細(xì)管電壓5 500 V,脫溶劑氣溫度550 ℃,噴霧器流速55PSI,定性、定量離子對和碰撞電壓(CE)及去簇電壓(DP)見表3。

表3 生物堿類化合物的質(zhì)譜參數(shù)

*為定量離子，其他為定性離子。

1.3.3樣品均勻性檢驗

按照GB/T 15000.5—1994對質(zhì)控樣進(jìn)行均勻性實驗，均勻性檢驗的總體樣本數(shù)共200個，順序編號后隨機(jī)抽取15個樣品進(jìn)行均勻性檢驗，每個樣品在重復(fù)條件下檢測3次為一組，共15組數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算組內(nèi)的均方差與組間均方差，以及各自的自由度，顯著性水平α，按方差檢驗給定的計算方法計算統(tǒng)計量F，通過GB/T 15000.5—1994附錄B，找出臨界值F，進(jìn)行比較，做出結(jié)論。

1.3.4樣品穩(wěn)定性檢驗

依據(jù)GB/T 15000.3—2008，質(zhì)控樣在進(jìn)行定值時，需考慮長期穩(wěn)定性(有效期)與短期穩(wěn)定性(運(yùn)輸條件下參考物質(zhì)的穩(wěn)定性)，因該參考物質(zhì)為常溫保存，可不考慮短期穩(wěn)定性，只考察長期穩(wěn)定性。實驗方法為在對質(zhì)控樣分裝后2、4、6、8、10、12、14個月考察穩(wěn)定性，每個時間點隨機(jī)抽取3個樣品，每個樣品平行測定2次，以3瓶樣品的總平均值為該時間穩(wěn)定性檢驗結(jié)果，0個月檢驗結(jié)果使用均勻性檢驗結(jié)果的總平均值；檢測方法與均勻性研究檢驗方法一致。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法依據(jù)GB/T 15000.3—2008采用線性擬合方程模型為穩(wěn)定性研究基本模型，可表示為Y=β0+β1X+ε，其中X為時間，Y為參考物質(zhì)的特性量值，β0、β1為回歸系數(shù)，ε為隨機(jī)誤差分量。對于穩(wěn)定性較好的樣品，β0為測定得到的值，β1期望值為0，X與Y之間的線性關(guān)系可用t檢驗法，具體方法如下。

直線斜率的計算式：

(1)

截距的計算式：

(2)

直線上點標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算式：

(3)

與斜率相關(guān)的不確定度的計算式：

(4)

1.3.5定值與不確定性評估

質(zhì)控樣的定值由10個通過資質(zhì)認(rèn)定的實驗室采用DB 31 2010—2012方法協(xié)作完成，檢測數(shù)據(jù)經(jīng)柯克倫檢驗，格拉布斯檢驗后取平均值進(jìn)行定值。

由于本批質(zhì)控樣采用的定值方式是由10家實驗室協(xié)同定值的方案，因此不確定度主要包括：短期穩(wěn)定性引入的不確定度、測定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度、瓶間差異引入的不確定度與長期穩(wěn)定性引入的不確定度。本批參考物質(zhì)定值方式是協(xié)同定值，短期穩(wěn)定性引入的不確定度已包含在實驗室的檢測值中，故可忽略不計，最終的不確定度由以上不確定度的合成不確定度表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻照殺菌條件的優(yōu)化

采用60Co-γ對包裝好的質(zhì)控樣進(jìn)行殺菌[17-18]，取33份獨立包裝的樣本，分別以0～10 kGy的輻照劑量進(jìn)行輻照，對輻照后的樣本取樣進(jìn)行微生物檢測以評價滅菌效果，細(xì)菌總數(shù)隨輻照劑量的變化趨勢如圖2，由圖2可以看出，當(dāng)輻照劑量達(dá)到6 kGy時，菌落總數(shù)達(dá)到無檢出的水平(<10 CFU/g),因此，輻照殺菌可以實現(xiàn)質(zhì)控樣的滅菌，為保證充分滅菌，最終選擇以7 kGy對質(zhì)控樣進(jìn)行輻照滅菌。

圖2 輻照對質(zhì)控樣中菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effects of irradiation on total number of colonies in quality control samples

為驗證60Co-γ輻照前后對質(zhì)控樣中生物堿類物質(zhì)的影響，對輻照前后樣本中的生物堿類物質(zhì)進(jìn)行檢測，5種生物堿類物質(zhì)隨輻照劑量的變化如圖3。由圖3可知，輻照前后生物堿類物質(zhì)的含量差異不明顯，因此60Co-γ輻照可以達(dá)到滅菌的效果，有效的延長了保質(zhì)期。

圖3 輻照對質(zhì)控樣中生物堿類物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of irradiation on alkaloids in quality control samples

2.2 樣品均勻性檢驗

按照DB 31 2010—2012方法對樣品進(jìn)行檢測，采用單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗樣品的均勻性，結(jié)果見表4，組間自由度為14，組內(nèi)自由度為30，查GB/T 15000.5—1994附錄B，F(xiàn)0.05(14，30)=2.31，由表可以看出5個組分的F值均小于F0.05(14，30)，表明樣品間不存在顯著性差異，證明所得的樣本是均勻的。

2.3 樣品穩(wěn)定性檢驗

按照1.3.4的方法對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結(jié)果見表5，查GB/T 15000.5—1994附錄F，得自由度為6，置信水平為0.95的t因子為2.48，由計算結(jié)果可以看出，|b1|

表4 固體復(fù)合香辛料中5種生物堿的均勻性檢驗結(jié)果

表5 固體復(fù)合香辛料質(zhì)控樣中5種生物堿的穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

2.4 質(zhì)控樣的定值

質(zhì)控樣的定值由10個認(rèn)可實驗室協(xié)作完成，采用的方法為DB 31 2010—2012，檢測數(shù)據(jù)見表6，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表6 10個實驗室質(zhì)控樣定值結(jié)果

2.4.1柯克倫檢驗

先利用柯克倫檢驗，對其標(biāo)準(zhǔn)差的最大值進(jìn)行檢驗，查看是否有離群數(shù)據(jù)，要求所有標(biāo)準(zhǔn)差都是在重復(fù)條件下獲得，且由相同數(shù)目計算結(jié)果得出。

柯克倫檢驗統(tǒng)計量計算式為：

(5)

將計算結(jié)果與臨界值作比較，C≤C5%，表示結(jié)果為正確值；C5%≤C≤C1%，表示結(jié)果為可疑值，需做進(jìn)一步分析；C≥C1%，表示結(jié)果為離群值，需將該結(jié)果剔除，其他數(shù)據(jù)作進(jìn)一步統(tǒng)計分析。協(xié)同定值的實驗室數(shù)P=10，每個實驗室測定數(shù)n=3，查柯克倫檢驗5%的臨界值為0.445，1%的臨界值為0.536。

對于可待因，2號實驗室與4號實驗室的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大,計算C=0.184,對于蒂巴因，5號實驗室的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大，計算C=0.188，對于嗎啡，5號實驗室的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大，計算C=0.188，對于罌粟堿，6號實驗室的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大，計算C=0.176，對于那可丁，3號實驗室的標(biāo)準(zhǔn)偏差最大，計算C=0.236。由以上計算結(jié)果可以看出，5個指標(biāo)的檢驗統(tǒng)計量C≤C5%，則10個實驗室的檢驗結(jié)果全部通過柯克倫檢驗。

2.4.2對10個實驗室的檢測均值進(jìn)行單值格拉布斯檢驗

實驗室數(shù)P=10，查格拉布速檢驗的臨界值表，G5%的臨界值為2.290，G1%的臨界值為2.482，經(jīng)計算5個指標(biāo)的G1

2.4.3對10個實驗室的檢測均值進(jìn)行雙值格拉布斯檢驗

雙格拉布斯檢驗量G2P的計算式為：

(6)

(7)

協(xié)同定值的實驗室數(shù)P=10，查格拉布速檢驗的臨界值表，G5%的臨界值為0.186 4，G1%的臨界值為0.115 0。經(jīng)計算，5個指標(biāo)的G2≥G5%，所有數(shù)據(jù)均為正確值，均可保留并參與定值。

2.5 不確定度評估

不確定度的評定參考GB/T 15000.3—2008，本批質(zhì)控樣采用的定值方式是由10家實驗室協(xié)同定值的方案，引入的不確定度主要包括測定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度μchar、瓶間差異引入的不確定度μbb、長期穩(wěn)定性引入的不確定度μlts、短期穩(wěn)定性引入的不確定度μsts，最終的不確定度由其合成不確定度表示。

2.5.1測定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

檢測數(shù)據(jù)經(jīng)柯克倫檢驗與格拉布斯檢驗分析，所有數(shù)據(jù)均可保留并參與最終定值，參考物質(zhì)的定值即為各實驗室平均值的均值，與平均值有關(guān)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定計算式為：

(8)

(9)

2.5.2瓶間差異引入的不確定度

在對質(zhì)控樣均勻性研究中，瓶間均勻性已被驗證，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，由下列公式計算瓶間差異引入的不確定度μbb。

瓶間方差計算式：

(10)

式(10)中MSamong為組間方差，MSwithin為組內(nèi)方差，n0為每組實驗個數(shù)。

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差計算式：

(11)

重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差計算式：

(12)

由瓶間均勻度引入的不確定度計算式：

(13)

其中P為實驗室個數(shù)。

2.5.3長期穩(wěn)定性引入的不確定度

穩(wěn)定性數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用線性擬合方程模型，由穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，在14個月期間樣品是穩(wěn)定的，長期穩(wěn)定性不確定度μlts的計算公式為μlts=Sb×t，由表5計算的Sb帶入公式計算得μlts。

2.5.4合成不確定度

質(zhì)控樣最終確定標(biāo)準(zhǔn)值由定值的總平均值與不確定度組成，結(jié)果為：可待因(907±20.9)μg/kg，蒂巴因(918±18.4)μg/kg，嗎啡(315±16.5)μg/kg，罌粟堿(171±12.6)μg/kg，那可丁(139±15.8)μg/kg。參考物質(zhì)的穩(wěn)定性只研究至14個月，則暫定其保質(zhì)期為14個月，如材料的穩(wěn)定性得到進(jìn)一步證明，則有效期還可延長。

表7 質(zhì)控樣不確定度評估表

3 結(jié) 論

本研究建立了一種固體復(fù)合香辛料中罌粟殼質(zhì)控樣的制備方法。在制備過程中采用了微波干燥技術(shù)，并控制水分含量在5%以下，該方法干燥條件短，且能很好地保持基質(zhì)材料和罌粟殼的原始狀態(tài)，有利于其粉碎，也能提高后期的混合效率；基體粉末與罌粟殼粉末混合采用三維混合法，該方式使混合的均勻程度達(dá)到最大化，效率高；拮抗劑的加入，可以防止質(zhì)控樣聚集結(jié)塊，保持其松散或自由流動，且不影響對生物堿類物質(zhì)的檢測；采用輻照殺菌，即能殺死微生物，延長保質(zhì)期，還能保證生物堿類物質(zhì)不被破壞；定值由10家通過認(rèn)可的實驗室協(xié)作完成，結(jié)果量值可靠，均勻性與穩(wěn)定性良好。利用該方法制備的質(zhì)控樣用于檢測方法的開發(fā)、檢測過程的質(zhì)量控制、實驗室能力驗證及在快速檢測領(lǐng)域應(yīng)用等具有重要意義。