放養(yǎng)密度對凡納濱對蝦苗種中間培育效果的影響*

張 龍 陳 釗 汪 魯 陳世波 張 鵬 曲克明 李秋芬 朱建新①

(1.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3.青島卓越海洋集團有限公司 青島 266400)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)生長速度快、耐鹽范圍廣、抗病力強，其產(chǎn)量約占全球?qū)ξr產(chǎn)量的70%。自 1987年引入我國以來，凡納濱對蝦迅速成為我國主要的對蝦養(yǎng)殖品種之一，養(yǎng)殖產(chǎn)量占全球總產(chǎn)量的 21%(黃志堅等, 2016)。目前，凡納濱對蝦養(yǎng)殖模式主要有池塘養(yǎng)殖、高位池養(yǎng)殖和工廠化養(yǎng)殖(岑伯明, 2010； 王峰等, 2013； 高欣等, 2017； 沈明明等, 2017)。池塘和高位池養(yǎng)殖模式存在水資源浪費嚴重、單位水體對蝦產(chǎn)量低、病毒性疾病頻發(fā)、污染周圍水體等缺點(董雙林等, 2000； 曲克明等, 2000)；而工廠化養(yǎng)殖具有換水量少、養(yǎng)殖密度高、可避免病原微生物侵襲等優(yōu)點(吳晨等, 2011)。因此，我國對蝦工廠化養(yǎng)殖規(guī)模呈逐年增加的趨勢。

在工廠化養(yǎng)殖中，為提高對蝦飼料利用率和促進對蝦快速生長，通常需要對蝦苗種進行中間培育，即對體長為 0.3～0.5 cm的凡納濱對蝦蝦苗進行集中飼養(yǎng)管理，使其快速生長至1～2 cm仔蝦的養(yǎng)殖過程。在對蝦苗種中間培育期間，放養(yǎng)密度、水質(zhì)、水體細菌數(shù)量及菌落組成的控制通常是決定對蝦苗種中間培育成敗的關鍵。放養(yǎng)密度過高會導致水質(zhì)惡化，加速細菌快速生長繁殖，改變水體中微生物群落結(jié)構(gòu)，進而影響?zhàn)B殖對蝦的患病概率和發(fā)病速度(丁美麗等,1997； 陳琛等, 2016； Apún-Molinaet al, 2017)。同時，放養(yǎng)密度還會對凡納濱對蝦的生理行為、免疫指標和能量轉(zhuǎn)化等產(chǎn)生重要影響，進而改變其生長速度和養(yǎng)殖產(chǎn)量(李純厚等, 2006； 李玉全等, 2007； 張?zhí)鞎r等,2008； 衣萌萌等, 2012)。目前，關于放養(yǎng)密度對凡納濱對蝦苗種中間培育效果的研究較為有限。本研究通過凡納濱對蝦養(yǎng)殖場實際苗種中間培育實驗，探究了放養(yǎng)密度對凡納濱對蝦生長性能、主要水質(zhì)指標及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為凡納濱對蝦工廠化養(yǎng)殖提供生產(chǎn)性技術指導。

1 材料和方法

1.1 實驗設施

本研究選取 12 個有效容積為 25 m3的水泥池(5 m × 5 m × 1 m)作為凡納濱對蝦苗種中間培育池，池底均勻布設100個氣石，采用空氣增氧；養(yǎng)殖用水為經(jīng)砂濾、消毒后的地下海水，鹽度為 31；每個池體上方棚頂設置 1 個采光口(3 m × 1 m)，光照控制在1000～1500 lx。實驗所用凡納濱對蝦苗種由青島卓越海洋集團有限公司培育，每尾平均體重為(6.0±0.5) mg。

1.2 實驗設計

鑒于養(yǎng)殖場凡納濱對蝦苗種中間培育實際放養(yǎng)密度一般為1.50萬尾/m3，本研究設置4個實驗組，放養(yǎng)密度分別為1.5萬尾/m3(P1組)、1.75萬尾/m3(P2組)、2.0萬尾/m3(P3組)和2.25萬尾/m3(P4組)，每個實驗組設 3個平行。實驗共進行 21 d。實驗前期(1～7 d)，每天投喂 3 次鹵蟲(Brine shrimp)無節(jié)幼體(粗蛋白含量為 57%)，投喂時間為 08：00、16：00 和 24：00；投喂蝦片(粗蛋白含量為 48%) 6次，投喂時間為06：00、09：00、12：00、15：00、18：00 和 21：00，鹵蟲無節(jié)幼體和蝦片日投喂總量為對蝦總重的10%；實驗中期(8～13 d)，混合投喂蝦片和對蝦商品配合飼料(粗蛋白含量為 42%)，蝦片所占比例由 75%逐漸降到25%，日投喂總量為對蝦總重的 8%，投喂次數(shù)和時間與實驗前期相同；實驗后期(14～21 d)，投喂對蝦商品配合飼料，日投喂量由對蝦總重的 8% 逐漸降到6%，投喂次數(shù)和時間同實驗前期。并每天向各個池體潑灑光合細菌和乳酸多肽，使養(yǎng)殖池內(nèi)二者濃度分別達到50、20 mg/L。

實驗初始，養(yǎng)殖池水位為0.6 m，前3 d為蝦苗適應期，不換水；從第3天開始, 每天補水0.1 m，補至0.9 m，補水時間為08：30；從第7天開始，每天換水1次，日換水量由養(yǎng)殖池內(nèi)高度增加0.05 m，逐漸遞增至0.30 m，換水時間與補水時間相同。在補、換水時，要保持較小的流量，以避免對蝦苗種產(chǎn)生應激反應，同時，各個養(yǎng)殖池內(nèi)補、換水量相同。實驗過程中，各養(yǎng)殖池內(nèi)水體溫度、鹽度、溶解氧分別保持在 28～30℃、31～32、5.8～6.0 mg/L。每天 08：00 采集水樣，測定各個養(yǎng)殖池內(nèi)氨氮(-N)和亞硝酸氮(-N)濃度以及弧菌(Vibrio)濃度；每3 d測定1次水體的化學需氧量(COD)，與上述測定指標采用同一批水樣。實驗結(jié)束后，各池內(nèi)隨機抽取50尾對蝦，對其生物學體長和體重進行測量，并計算平均值；同時, 檢測各個養(yǎng)殖池內(nèi)養(yǎng)殖水體的微生物群落。

1.3 分析方法

1.3.1 對蝦生長性能 實驗結(jié)束后，排干養(yǎng)殖池水并收獲對蝦。分別使用游標卡尺和電子天平測量各養(yǎng)殖池內(nèi)凡納濱對蝦的生物學體長和體重，并分別計算對蝦的產(chǎn)率、特定增長率、存活率以及餌料轉(zhuǎn)化率，公式如下：

產(chǎn)率(Yield rate,YR) = (收獲對蝦總重量-放苗對蝦總重量)/放苗對蝦總重量

特定生長率(Specific growth rate, SGR, %/d) =[ln(對蝦收獲體重)-ln(對蝦初始體重)] × 100/(實驗天數(shù))

存活率(Survival rate, SR, %) = 對蝦收獲數(shù)量/對蝦放苗數(shù)量 × 100

餌料轉(zhuǎn)化率(Feed conversion rate, FCR, %) = 飼料利用干重/對蝦收獲增重 × 100

1.3.2 常規(guī)水質(zhì)指標 利用水質(zhì) YSI 556 檢測儀(美國)監(jiān)測水體溫度、溶解氧、pH和鹽度。-N、-N和COD濃度分別采用采用靛酚藍分光光度法、鹽酸萘乙二胺分光光度法和堿性高錳酸鉀法測定?；【鷿舛炔捎猛坎计桨宓姆椒y定，將0.1 ml水樣使用涂物棒均勻涂布在TCBS培養(yǎng)基上，24 h后觀測和記錄培養(yǎng)基上菌落數(shù)量。

1.3.3 微生物群落 實驗結(jié)束后，使用1 L的滅菌聚乙烯瓶采集水樣，將水樣放置搖床，于 300 r/min搖晃10 min后，用0.22 μm孔徑無菌濾膜抽濾。抽濾膜使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取水樣DNA，利用帶有 Barcode的特異性引物(515F和 806R)對提取的水樣基因組DNA的16S V4區(qū)進行PCR擴增。在 PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建。若文庫合格，使用HiSeq 2500 PE250進行上機測序。

下機數(shù)據(jù)在截取 Barcode和引物序列后，使用FLASH 1.2.7軟件對樣品Reads進行拼接，得到原始數(shù)據(jù)(Raw Tags)(Mago?et al, 2011)；利用 Qiime 1.9.1軟件對Raw Tags進行過濾處理，得到高質(zhì)量 Tags 數(shù)據(jù)(Clean Tags)(Caporasoet al, 2010； Bokulichet al,2013)；Clean Tags序列通過(UCHIME Algorithm)與數(shù)據(jù)庫(Gold database)進行比對(Edgaret al, 2011)，去除其中的嵌合體序列(Hasset al, 2011)，得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。使用 Uparse v7.0.1001軟件將所有 Effective Tags 聚類(97%)成為操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs) (Edgar, 2013)；通過 Mothur方法與 SILVA的 SSUrRNA數(shù)據(jù)庫 OTUs 對比進行物種注釋(Wanget al, 2007； Quastet al, 2013)。通過香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)確定水樣細菌生物多樣性。使用Origin.8軟件對水樣細菌相對豐度(門和屬)進行制圖。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 采用 SPPS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析、差異顯著性檢驗分析，用t檢驗計算P值，P＜0.05時，為差異顯著，P＜0.01時，為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 密度對凡納濱對蝦生長性能的影響

不同放養(yǎng)密度對凡納濱對蝦生長性能的影響見表1。從表1可以看出，實驗結(jié)束后，各養(yǎng)殖池蝦苗的平均體重增加了9.3～10.5倍。在放養(yǎng)密度為1.50～2.25萬尾/m3條件下，凡納濱對蝦YR、SGR、SR以及FCR均隨著放養(yǎng)密度的增加而逐漸升高。

表1 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)凡納濱對蝦的生長性能Tab.1 Performance parameters of L.vannamei in ponds with different stocking densities

2.2 放養(yǎng)密度對水質(zhì)的影響

圖1 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)水體pH變化Fig.1 pH variations of aquaculture water in ponds with different stocking densities

2.2.1 pH 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池中水體 pH隨實驗的進行整體呈現(xiàn)下降的趨勢(圖 1)。實驗期內(nèi)，各組pH由8.00分別降低至7.72、7.66、7.67和7.59，而實驗后期，換水量的增加能有效抑制pH的下降。P1、P2、P4組間水體的pH存在顯著差異(P＜0.05)，而P2、P4組水體pH較為接近。總體而言，水體pH隨著放養(yǎng)密度的增加而降低。

2.2.2 氨氮和亞硝酸氮濃度 隨著凡納濱對蝦苗種中間培育實驗的進行，各實驗組水體-N濃度均呈逐漸上升趨勢(圖 2)。實驗結(jié)束時，各密度組水體-N濃度分別達到3.53、4.23、4.88和5.55 mg/L。水體-N濃度隨著對蝦放養(yǎng)密度的增加而升高，且不同放養(yǎng)密度組間差異顯著(P＜0.05)。-N濃度在實驗前期(1～7 d)變化緩慢，在實驗中后期(8～21 d)快速上升。實驗結(jié)束時，各密度組水體-N濃度分別達到 0.20、0.24、0.21和0.02 mg/L，但不同放養(yǎng)密度組間-N濃度差異并不顯著(P＞0.05)。

2.2.3 COD 濃度 實驗前、中期(1～13 d)，水體COD濃度呈上升趨勢；實驗后期(14～21 d)，隨著換水量的增加，水體COD濃度呈現(xiàn)下降的趨勢(圖3)。實驗結(jié)束時，各密度組水體COD濃度分別達到6.4、7.2、7.6和7.8 mg/L。COD濃度隨放養(yǎng)密度的增加而有所增加，且不同密度組間差異顯著(P＜0.05)。

圖2 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)水體氨氮和亞硝酸氮濃度變化Fig.2 Variations of ammonia and nitrite concentrations of aquaculture water in ponds with different stocking densities

圖3 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)水體COD濃度的變化Fig.3 Variations of COD concentrations of aquaculture water in ponds with different stocking densities

2.2.4 水體弧菌濃度 實驗前、中期，水體中弧菌濃度保持相對穩(wěn)定，為(0.3～3.0)×104CFU/ml；實驗后期，受日換水量增加的影響，各實驗組水體弧菌濃度存在一定程度的波動，其中，P4組波動最大(圖4)。實驗結(jié)束時，各實驗組水體弧菌濃度分別為2.3×104、1.8× 104、3.8×104和 4.3×104CFU/ml，弧菌濃度與養(yǎng)殖密度不存在相關性。

2.3 放養(yǎng)密度對水體微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 細菌生物多樣性 香農(nóng)指數(shù)在一定程度上可以反映水體中細菌的生物多樣性，通常香農(nóng)指數(shù)越大，說明其生物多樣性越高(Cardonaet al, 2016)。從圖5可以看出，各實驗組間香農(nóng)指數(shù)存在顯著性差異(P＜0.05)，其中，P1、P2組存在極顯著差異(P＜0.01)，P2組香農(nóng)指數(shù)明顯高于其他各組?？傮w而言，香農(nóng)指數(shù)隨養(yǎng)殖密度的升高呈現(xiàn)上升的趨勢。

圖4 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)水體弧菌濃度變化Fig.4 Variations of Vibrio concentration of aquaculture water in ponds with different stocking densities

圖5 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)水體細菌香農(nóng)指數(shù)Fig.5 Bacteria Shannon diversity index of aquaculture water in ponds with different stocking densities

2.3.2 水體中細菌優(yōu)勢種群 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)細菌群落的主要組成見表2。從表2可以看出，變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為各組水體的主要細菌門類。α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)紅桿菌科(Rhodobacteraceae)和γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)弧菌科(Vibrio)在變形菌門中分別占 46%～81%和 2%～23%。黃桿菌綱(Flavobacteriales)黃桿菌科(Flavobacteriales)、 鞘氨醇桿菌綱(Sphingobacteriales)腐螺旋菌科(Saprospiraceae)和噬纖維菌綱(Cytophagales)Algorriphogus菌科分別占擬桿菌門的3%～13%、21%～44%和8%～62%。

表2 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)細菌群落的主要成分(門水平)Tab.2 Major component of the bacterial community in ponds with different stocking densities (Phyla)

實驗結(jié)束時，各實驗組水體主要菌屬的相對豐度見圖6。從圖6可以看出，P1組Algorriphogus的相對豐度最高(13.5%)，弧菌屬次之(5.1%)；P2和P4組弧菌屬的相對豐度最高(9.4%、8.1%)，棲東海菌屬(Donghicola)次之(5.3%、8.0%)；P3組弧菌屬相對豐度最高(2.3%)，海命菌屬(Marivita)次之(1.8%)。弧菌屬在不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池水體中均為優(yōu)勢菌屬。

圖6 不同放養(yǎng)密度養(yǎng)殖池內(nèi)主要細菌菌屬的相對豐度Fig.6 Relative abundance of major bacterial genus in ponds with different stocking densities

3 討論

3.1 放養(yǎng)密度對凡納濱對蝦生長性能的影響

SR及SGR是影響凡納濱對蝦YR的直接因素。因此，本研究以對蝦YR來衡量凡納濱對蝦苗種中間培育效果。結(jié)果顯示，在放養(yǎng)密度為1.5～2.25萬尾/m3條件下，隨著放養(yǎng)密度的增加，凡納濱對蝦SR、SGR及YR均逐漸升高。這與李純厚等(2006)、李玉全等(2007)、衣萌萌等(2012)研究結(jié)果相悖，這主要是由于對蝦苗種中間培育階段對蝦規(guī)格小、密度低，同時，因密度脅迫所產(chǎn)生的空間擁擠效應并不明顯(Ngaet al, 2005)。本研究結(jié)果顯示，當放養(yǎng)密度為1.5～2.25萬尾/m3時，適當提高養(yǎng)殖密度有利于提升凡納濱對蝦苗種中間培育效果。其主要原因在于本研究設定的放養(yǎng)密度范圍內(nèi)，當放養(yǎng)密度較高時，單位水體餌料投喂量較大，有利于對蝦對餌料的攝取。因此，在凡納濱對蝦苗種中間培育實際工廠化養(yǎng)殖中，也可以將對蝦苗種中間培育實際放養(yǎng)密度由 1.5萬尾/m3增加至 2.25萬尾/m3，以提高養(yǎng)殖對蝦產(chǎn)量和增加養(yǎng)殖效益。

3.2 放養(yǎng)密度對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

養(yǎng)殖水體水質(zhì)受餌料投喂、凡納濱對蝦生理活動(攝食、排泄、呼吸代謝等)以及水體微生物代謝的影響(劉嬌等, 2008)。在對蝦苗種中間培育過程中，對蝦及微生物呼吸代謝產(chǎn)生的CO2積累，導致水體pH逐漸下降。放養(yǎng)密度和微生物豐度越高，水體pH下降越快。餌料是水體有機物負荷的主要來源，隨著對蝦養(yǎng)殖個體的增大和養(yǎng)殖密度的加大，飼喂量逐步提高，從而導致水體COD濃度的上升。餌料中蛋白質(zhì)含量較高則是導致水體中-N和-N濃度升高的主要原因。在對蝦苗種中間培育期間，隨著對蝦養(yǎng)殖個體的增大和養(yǎng)殖密度的加大，餌料投喂量進一步加大，從而導致水體-N和-N濃度的上升。本研究表明，放養(yǎng)密度較大的養(yǎng)殖池內(nèi)水體pH較低，而-N和COD濃度較高，與丁美麗等(1997)研究的結(jié)果相吻合。

為避免水質(zhì)惡化，換水是調(diào)節(jié)水質(zhì)指標的有效措施，也是養(yǎng)殖企業(yè)最常用的方法。實驗期間，隨著凡納濱對蝦養(yǎng)殖個體的增大和養(yǎng)殖密度的加大而逐步提升換水量，最大換水量占總水體的33%，在一定程度上抑制水體pH的下降和COD濃度的升高，但對調(diào)節(jié)-N和-N濃度作用有限。實驗結(jié)束時，-N 濃度達到 3.53～5.80 mg/L，超出了姚慶禎等(2002)研究的對蝦養(yǎng)殖安全濃度(0.79 mg/L)，但是，實驗過程中，尚未發(fā)現(xiàn)該濃度對凡納濱對蝦苗種生長和SR構(gòu)成影響。結(jié)果顯示，在本研究條件下，換水對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的調(diào)節(jié)能力有限。然而，增大換水量在增加生產(chǎn)成本的同時，也可能造成凡納濱對蝦產(chǎn)生應激反應，對其生長存活產(chǎn)生負面影響，因此，需要引入更加高效的對蝦養(yǎng)殖模式(如生物絮團養(yǎng)殖、循環(huán)水養(yǎng)殖)為凡納濱對蝦養(yǎng)殖提供穩(wěn)定的水質(zhì)保證(張許光等, 2013)。

在對蝦養(yǎng)殖過程中，弧菌往往作為致病菌或者條件致病菌存在，因而成為養(yǎng)殖水體檢測的重要微生物指標(張彬等, 2015； 黃志堅等, 2016)。本研究表明，對蝦放養(yǎng)密度與水體弧菌濃度無顯著相關，這與Cao等(2013)的研究結(jié)果較吻合。實驗后期，各實驗組水體的弧菌濃度波動較大，這可能是由實驗后期換水量較大所致。整個實驗過程中，各養(yǎng)殖池水體弧菌濃度始終處在安全濃度以內(nèi)(1.0×107CFU/ml) (Gullianet al, 2004)。但是，弧菌濃度超標依然是工廠化養(yǎng)殖中對蝦死亡的重要原因之一，其致病機理和安全濃度值得進一步研究。

3.3 放養(yǎng)密度對水體細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

養(yǎng)殖水體細菌生物多樣性和菌落結(jié)構(gòu)受養(yǎng)殖生物種類、數(shù)量以及水體、水質(zhì)等因素的影響。本研究結(jié)果表明，隨放養(yǎng)密度的增大，養(yǎng)殖水體中細菌生物多樣性總體上呈現(xiàn)上升趨勢。這是因為放養(yǎng)密度較高時，水體中COD、-N和-N濃度較高，為多種類型細菌的生長繁殖提供了較豐富的C源和N源(王以堯等, 2011； 陳琛等, 2016)。對蝦放養(yǎng)密度不僅會影響?zhàn)B殖水體中細菌生物多樣性，還會改變細菌的群落結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，在水體細菌屬水平上，P1組內(nèi)相對豐度最大的菌屬為Algorriphogus屬，而P2、P3、P4組為弧菌屬；P1～P4組內(nèi)相對豐度處在第2位的菌屬分別為弧菌屬、棲東海菌屬、海命菌屬和棲東海菌屬。

養(yǎng)殖水體中，細菌生物多樣性和菌落結(jié)構(gòu)對凡納濱對蝦內(nèi)部細菌的生長具有重要影響，并在對蝦的營養(yǎng)利用、提高免疫力等方面發(fā)揮著重要作用(Luoet al,2006； 李玉宏等, 2014)。在放養(yǎng)密度較高的養(yǎng)殖池水體中，細菌生物多樣性也較高，這可以提高養(yǎng)殖系統(tǒng)的穩(wěn)定性，降低致病菌或條件致病菌成為優(yōu)勢菌群的可能性，從而可能在一定程度上降低凡納濱對蝦的發(fā)病率。而且，良好的菌落組成可以降低水體有機物負荷，改善對蝦腸道環(huán)境，從而提高對蝦的免疫力和抗病力(Apún-Molinaet al, 2017)。

4 結(jié)論

在凡納濱對蝦苗種中間培育期間，放養(yǎng)密度(1.5～2.25 萬尾/m3)的增加提高了凡納濱對蝦的生長性能(產(chǎn)率、特定生長率、存活率及餌料轉(zhuǎn)化率)。

在凡納濱對蝦苗種中間培育期間，放養(yǎng)密度提高能有效提升養(yǎng)殖池內(nèi)的細菌生物多樣性；養(yǎng)殖池內(nèi)主要的細菌門類為變形菌門和擬桿菌門，弧菌為養(yǎng)殖水體中的優(yōu)勢菌屬。