長絲裂腹魚溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏檢測

雷雪平，耿 毅，鄧龍君，甘維熊，黃小麗，陳德芳，歐陽萍

( 1.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130； 2.雅礱江水電開發(fā)有限公司，四川 西昌 615000 )

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)廣泛分布于自然界，是一種常見的人—獸—魚共患條件致病菌[1-2]，可致人類急性胃腸道感染[3]、創(chuàng)傷感染[4]和腦膜炎[5]等；也可感染尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[7]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[8]等多種淡水魚類，引起腹水病[9]、皮膚潰瘍[10-11]和出血性敗血癥[12]等；同時也對中華鱉(Trionyxsinensis)[13]、牛蛙(Ranacatesbiana)[14]、大鯢(Andriasdavidianus)[15]等兩棲類和爬行類水生動物致病，給人類與水產(chǎn)養(yǎng)殖都造成較大的威脅。

長絲裂腹魚(Schizothoraxdolichonema)，是長江上游的特有魚類。近年來，由于梯級水電站的建立，破壞了河流的連續(xù)性，阻礙了魚類的分布與洄游，加之人類大量的捕撈，導致長絲裂腹魚資源量急劇下降，已被《中國物種紅色名錄》記錄為瀕危物種。2017年4月，西昌某養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的長絲裂腹魚暴發(fā)一種以出血和角膜發(fā)白為主要特征的疾病，導致長絲裂腹魚的死亡率達20%。為探究此次發(fā)病之病因，自發(fā)病魚體內(nèi)分離純化病原菌，獲得病原菌優(yōu)勢菌株LXP170412。通過表型特征測定、16S rDNA與gyrB基因序列分析鑒定，菌株LXP170412為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。進一步進行病原菌的藥敏試驗，以期為有效防治該病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病長絲裂腹魚采自西昌某養(yǎng)殖場，具有明顯臨床癥狀，體質量352.5～674.7 g；健康長絲裂腹魚購于四川攀西某養(yǎng)殖場，體質量(246.2±15.3) g。腦心浸液瓊脂(北京欣經(jīng)科生物技術有限公司)；MH培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)；細菌DNA提取試劑盒、Mix、DNA分子Marker[天根生化科技(北京)有限公司]；藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)；細菌生化微量鑒定管(杭州微生物試劑有限司)。

1.2 病原菌的分離純化

無菌條件下，自病魚肝、脾、腎取樣，劃線接種于腦心浸液瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)、大小一致的單個優(yōu)勢菌落，于腦心浸液瓊脂平板上再次劃線，獲得純培養(yǎng)菌株，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗

將獲得的優(yōu)勢培養(yǎng)菌株LXP170412接種到腦心浸液瓊脂平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水洗下，用麥氏比濁法調整細菌密度分別為2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL。健康長絲裂腹魚暫養(yǎng)7 d后，腹腔注射0.5 mL不同密度的菌液進行人工感染，對照組魚注射等量無菌生理鹽水，試驗期14 d。攻毒后每日觀察試驗魚的癥狀和發(fā)病死亡情況，對死亡魚及時進行剖檢和致病菌的再次分離。

1.4 病原菌菌株表型特性測定

觀察分離菌的菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)。挑取單個菌落接種于微量生化反應管，28 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)生化鑒定管的說明書判定結果，并根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]對菌株進行初步鑒定。

1.5 病原菌16S rDNA與gyrB基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取新鮮細菌基因組DNA。采用一對擴增細菌16S rDNA基因的通用引物[17](上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)和gyrB基因通用引物[18][上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3′；下游引物：5′-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3′]分別擴增16S rDNA基因與gyrB基因，預期擴增片段大小分別約為1500 bp與1200 bp。其反應體系與條件參照文獻[19]。反應結束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小并回收純化。純化后產(chǎn)物送成都擎科有限公司測序。將分離菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列GenBank中已知核酸序列進行Blast比對分析，分別調出與其同源性較高的序列進行多序列比對，用Mega 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 病原菌藥物敏感性檢測

采用紙片擴散法進行藥物敏感性檢測，將分離菌株接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 24 h，麥氏比濁法調整菌液密度為2.0×108cfu/mL，將菌液均勻涂布于MH平板上，貼上藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小，并參照美國臨床實驗室標準化研究所抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準(M100-S18)判定菌株對藥物的敏感性。

2 結 果

2.1 臨床癥狀及剖解檢查

患病裂腹魚主要表現(xiàn)為食欲減退甚至絕食，體色變淡，眼角膜混濁(圖1a)，體表、鰭條基部、下頜及鰓蓋等出血(圖1a、b)。解剖病魚發(fā)現(xiàn)，肝腫大、淤血，邊緣鈍圓，呈紫紅色；脾腫大，呈暗紅色(圖1c)；腎腫大、出血(圖1d)；鰾壁明顯充血、出血；部分病魚膽囊腫大、脂肪充血、出血，腹腔內(nèi)少量腹水。

圖1 長絲裂腹魚感染溫和氣單胞菌的體征a.下頜出血，眼角膜混濁(箭頭)； b.體表出血(箭頭)； c.脾臟腫大(箭頭)，鰾壁充血、出血； d.膽囊腫大，腎腫大，出血(箭頭).

2.2 病原菌的分離與形態(tài)特性觀察

自病魚的肝、脾和腎組織中分離獲得一株優(yōu)勢菌LXP170412。28 ℃培養(yǎng)24 h，分離菌株在腦心浸液瓊脂平板上生長良好，形成圓形、表面光滑、半透明狀、邊緣整齊、略凸起、無水溶性色素的菌落(圖2a)。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體呈革蘭氏陰性短桿狀，兩端鈍圓，多數(shù)單個排列，無莢膜，無芽孢(圖2b)。

圖2 菌株LXP170412菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色(b)

2.3 人工感染試驗

注射菌液，2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL密度組在注射感染第2 d出現(xiàn)反應遲緩、游動異常、體表鰭基出血，并開始出現(xiàn)死亡，至試驗結束時，各密度組死亡率分別為90%、60%、20%與10%，發(fā)病死亡魚主要表現(xiàn)為體表與內(nèi)臟器官的充血與出血，與自然發(fā)病魚的臨床特征相似，而對照組則在整個試驗期內(nèi)無任何異常。由人工感染發(fā)病死亡的長絲裂腹魚體內(nèi)再次分離細菌，獲得與感染接種菌形態(tài)、理化特性與16S rDNA基因序列一致的菌株。采用寇氏法計算，分離菌對長絲裂腹魚的半致死密度為1.002×107cfu/mL。試驗結果表明，該分離株是此次患病長絲裂腹魚的病原菌。

表1 菌株LXP170412人工感染試驗結果

2.4 病原菌的理化特性

分離菌株LXP170412的主要生理生化特性見表2，它與溫和氣單胞菌生理生化特性基本一致，初步判定為溫和氣單胞菌。

2.5 病原菌16S rRNA與gyrB 基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用擴增16S rRNA基因和gyrB基因的通用引物，擴增出分離株的16S rRNA基因和gyrB基因，分別得到預期大小的條帶。純化測序后分別得到長度為1410 bp和1107 bp的片段，GenBank基因登陸號分別為MG356656與MG356657，在GenBank中與已知核酸序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)分離菌與溫和氣單胞菌的同源性最高，分別高達100%和98%。在基于分離菌的16S rRNA和gyrB序列與GenBank中同源性較高的氣單胞菌屬細菌16S rRNA及gyrB基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹上，該分離菌株與溫和氣單胞菌聚為一族(圖2、圖3)。結合生理生化特性分析，確定菌株LXR170412為溫和氣單胞菌。

2.6 藥物敏感性檢測

溫和氣單胞菌LXP170412對18種抗生素的敏感性見表3。由表3可知，溫和氣單胞菌LXP170412僅對諾氟沙星、氧氟沙星、強力霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟6種藥物敏感，對氟苯尼考、紅霉素中度敏感，對新霉素、恩諾沙星、慶大霉素、羅紅霉素、復方新諾明、四環(huán)素、丁胺卡那、青霉素、阿莫西林、頭孢拉定10種藥物耐藥。

表2 分離株LXP170412的生理生化特性

注：“+”為陽性，“-”為陰性，“”為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“d”為種間不同反應.

圖2 基于16S rDNA基因序列構建的分離菌株LXP170412與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于gyrB基因序列構建的分離菌株LXP170412與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

藥物藥物含量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性藥物藥物含量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性新霉素3012R四環(huán)素3010R恩諾沙星1024R環(huán)丙沙星522S諾氟沙星1023S紅霉素1517I慶大霉素1012R丁胺卡那3013R氧氟沙星528S青霉素106R羅紅霉素1512R阿莫西林106R氟苯尼考3017I頭孢拉定3010R強力霉素3016S頭孢噻肟3041S左氧氟沙星524S復方新諾明23.756R

注：“R”為耐藥，“S”為敏感，“I”為中度敏感.

3 討 論

溫和氣單胞菌廣泛存在于水環(huán)境中，可引起魚類及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動物多種疾病，是一種重要的條件致病菌[10]。據(jù)報道，該菌可以感染黃顙魚[20]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[21]、河鱸(Percafluviatilis)[22]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)[2]等多種養(yǎng)殖魚類，并引起大量死亡，也能引起牛蛙潰瘍癥[14]和鱉敗血癥[23]。本研究自臨床癥狀表現(xiàn)為體表出血與眼角膜渾濁的自然發(fā)病長絲裂腹魚體內(nèi)分離到一株革蘭氏陰性桿菌，并通過其表型和分子生物學特性鑒定其即為溫和氣單胞菌，人工感染證實，溫和氣單胞菌自然情況下也可感染并致死長絲裂腹魚。在長絲裂腹魚的養(yǎng)殖中應重視溫和氣單胞菌所造成的危害。

近年來，就溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等條件性致病菌對水生動物具有強致病性不斷見諸報道[24-29]，條件性致病菌感染已成為威脅我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要疾病之一。對于這些條件致病菌感染的發(fā)生機制，尤其是水質環(huán)境因素在其感染與致病中的作用尚不完全清楚，在本次取樣時發(fā)現(xiàn)，發(fā)病場池塘的底質較厚，水體有機質含量較高，這是否與本次溫和氣單胞菌感染致病有關值得進一步研究，以便為更好的防控這些條件性致病菌的危害提供依據(jù)。長絲裂腹魚自然感染溫和氣單胞菌后，臨床癥狀主要表現(xiàn)為反應遲鈍、食欲減退，體表褪色，肌肉與鰭條充血、出血；內(nèi)臟器官淤血、出血，呈明顯的敗血癥狀。與羅非魚[30]和金魚(Carassiusauratus)[31]感染溫和氣單胞菌的癥狀相似，但也與嗜水氣單胞菌[32]與遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[33]等感染的臨床表現(xiàn)較為相似，給臨床診斷帶來困難。因此，提高魚類疾病診斷的準確性應強化實驗室診斷的作用。

溫和氣單胞菌LXP170412雖然對諾氟沙星、氧氟沙星、強力霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物敏感，但我國相關法規(guī)已明令禁止諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星與環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物在食用動物養(yǎng)殖中的使用；同時該菌對動物專用的恩諾沙星、氟苯尼考等耐藥或中度敏感。在本次病例中養(yǎng)殖者曾用恩諾沙星進行內(nèi)服治療，結果無效，改用強力霉素才有效控制了疫情。由此可見，臨床用藥應根據(jù)藥敏試驗結果選擇用藥，以提高用藥的有效性，避免藥物濫用。另外，溫和氣單胞菌是一種廣泛分布于水環(huán)境中的條件致病菌，其感染往往與水溫、水質、養(yǎng)殖密度、應激等有關[34]，因此，在養(yǎng)殖環(huán)境控制與飼養(yǎng)管理上也應進行相應的改善工作以降低該病的發(fā)生風險。