基于網(wǎng)絡藥理學試述消癌解毒方組方中君臣關(guān)系及其防治肝癌的研究＊

朱恒舟，季 漪，馬艷霞，譚佳妮，2，李文婷，2，吳勉華，2＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 南京210000；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京210000）

1 前言介紹

惡性腫瘤是導致人類死亡的主要原因之一。《2015中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》顯示[1]，2015年中國預計有429.2萬例新發(fā)腫瘤病例和281.4萬例死亡病例，腫瘤已經(jīng)成為一種常見疾病。近年來中醫(yī)藥以其多部位、多靶點的整體調(diào)控作用，在改善腫瘤患者的臨床癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存周期及減輕放化療毒副反應方面顯示出其獨特的臨床療效，因而受到了廣泛關(guān)注。

消癌解毒方是國醫(yī)大師周仲瑛教授根據(jù)其“癌毒”病機理論及數(shù)十年臨床經(jīng)驗所提出的治療惡性腫瘤臨床有效驗方，該方由白花蛇舌草、山慈菇、僵蠶、蜈蚣、太子參、麥冬、八月札組成，方中以白花蛇舌草清熱解毒為君藥；山慈菇化痰軟堅、太子參益氣養(yǎng)陰為臣藥；佐以麥冬、八月札理氣解郁，益氣養(yǎng)陰；僵蠶、蜈蚣消結(jié)散腫，扶正消癌。全方共奏消癌解毒、扶正祛邪之功效。韓淳淳[2]通過20例未行手術(shù)治療或出現(xiàn)復發(fā)轉(zhuǎn)移的肝癌帶瘤生存患者進行服用消癌解毒方前后的中醫(yī)臨床癥狀、腫瘤標志物及瘤灶情況進行比較、分析，發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可改善肝癌中晚期患者的臨床癥狀，穩(wěn)定病情。周紅光[3]通過將198例Ⅲ-Ⅳ期腫瘤患者分為化療+中藥組（治療組），單純化療組（對照組）進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消癌解毒方能提高中晚期惡性腫瘤近期臨床療效，減少化療藥物的毒副反應，明顯提高患者的生活質(zhì)量，是一種發(fā)展前景較好的抗癌藥物。通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，課題組前期研究驗證消癌解毒方具有抗腫瘤的效果，并初步探討了其作用機理，但是并沒有從生物信息學角度對其防治腫瘤靶點有效性及組方合理性進行探討。本文運用網(wǎng)絡藥理學理論方法，對消癌解毒方防治腫瘤靶點有效性及組方合理性進行初探，運用現(xiàn)代生物技術(shù)手段闡釋其抗腫瘤機制，并通過網(wǎng)絡藥理學“網(wǎng)絡標靶”[4-5]手段從現(xiàn)代生物技術(shù)層次論述了消癌解毒方組方君臣關(guān)系的合理性，為后續(xù)研究做鋪墊。

1 材料及方法

1.1 消癌解毒方中藥物有效活性成分的分析

消癌解毒方為臨床應用有效的防治腫瘤的經(jīng)驗方，本研究依托中藥藥理分析平臺[6]（TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）分析其中藥物白花蛇舌草有，太子參以及山慈菇的有效成分，同時通過設置口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18的篩選標準或許藥物有效化合物，通過此方法獲得的化合物再利用美國國家健康研究院PubChem平臺（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證目標所化合物的有效性。

1.2 消癌解毒方中有效活性成分靶點的預測

利用Swiss Target Prediction平臺[7-8]（http://www.swisstargetprediction.ch/），結(jié)合消癌解毒方中的有效化合物，預測出白花蛇舌草、太子參、山慈菇對應的靶點，并且將種屬關(guān)系選擇為人類。

1.3 肝癌對應靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建

目前對于疾病靶點基因研究較為完善的數(shù)據(jù)庫有DisGeNET[9-10]（http://www.disgenet.org），人類孟德爾遺傳研究平臺OMIM（http://www.omim.org/），治療靶點數(shù)據(jù)庫TTD[11]（http://biddnus.edu.sg/BIDD-Database/TTS/TTS.asp），PharmGkb[12-13]數(shù)據(jù)庫（http://pharmgkb.org/），本研究通過檢索關(guān)鍵詞“hepatic”“l(fā)iver”“hepatocellular”“cancer”“tumor”“neoplasm”，在各個數(shù)據(jù)庫中的表達數(shù)據(jù)，刪除重復靶點，從而構(gòu)建針對肝癌所形成的獨特的靶點網(wǎng)絡。

1.4 靶點基因互作網(wǎng)絡的構(gòu)建

靶點基因的表達最終會以蛋白的形式的細胞體內(nèi)進行表達，通過STRING數(shù)據(jù)庫，聯(lián)合分析藥物有效的靶點基因以及肝癌相關(guān)的靶點基因的之間的關(guān)系，借助Cytoscape 3.2（http://cytoscape.org），構(gòu)建出藥物與疾病之間密切聯(lián)系的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡互作圖。

1.5 目標基因生物功能學注釋及通路分析及其可視化分析

本研究采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）對PPI網(wǎng)絡中的蛋白進行GO功能富集分析，通過KEGG通路富集的信號通路中的相關(guān)信息對消癌解毒方中有效成分作用靶點位置進行分析，并構(gòu)建相關(guān)分析圖。利用R包clusterProfiler[14]進行數(shù)據(jù)分析及可視化。

1.6 細胞培養(yǎng)

人肝癌SMMC7721細胞購自中國科學院上海細胞庫細胞庫，培養(yǎng)條件：10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，放入5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育。

1.7 含藥血清制備

消癌解毒方由白花蛇舌草20 g，山慈菇10 g，麥冬12 g，太子參15 g，八月札12 g，僵蠶10 g，蜈蚣3 g組成（藥材購自安徽省亳州市中西藥有限公司，由南京中醫(yī)藥大學藥學院教授鑒定均符合《中華人民共和國藥典》2015年版要求）。藥物以10倍體積水，浸泡1 h后大火煮開，再小火煮2 h，取濾液。剩余藥渣加8倍體積水繼續(xù)煮1.5 h，取濾液。兩次濾液混合均勻后濃縮成生藥量2 g/mL的藥液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

取30只SD大鼠雌雄各半，平均體重（200±10）g，許可證號：SCXK（蘇）2016-0003。按照消癌解毒方低中高濃度組（10 mg/kg，20 mg/kg，40 mg/kg）給藥7天后提取含藥血清。

1.8 CCK8法檢測人結(jié)腸癌SW480細胞增殖活力

取各組加藥后對數(shù)期的細胞，制備細胞懸液，細胞濃度調(diào)整為3×105/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10μL CCK8溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標儀在490 nm波長處測定并記錄各組吸廣度，計算細胞增殖活力。

1.9 劃痕實驗

用記號筆在6孔板背后，劃出均勻的5條線。每孔加入約5*105個細胞，24 h后用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，在各組中按照對應濃度加入消癌解毒方含藥血清培養(yǎng)基200μL，刺激24 h。正常對照組只加入等量的PBS緩沖溶液，放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出，拍照。

1.10 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

各組細胞用PBS沖洗2遍，加入不含EDTA的胰蛋白酶將細胞消化后收集細胞，1 000 r/min離心5 min，定容至500個/mL，按照AnnexinⅤ/PI試劑盒加入工作液及染料，震蕩均勻，避光靜置5 min后，上機檢測。

1.11 Wester n Blot分 析7721細 胞 內(nèi)BAX、Bcl-2，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平

取生長密度帶到80%的細胞，加入RIPA裂解液（含PMSF），反復吹打。后置于冰上裂解30 min，低溫離心（4℃，10 000 r/min）10 min后取上清液，BCA法測蛋白濃度，加上樣緩沖液混勻，高溫變性后分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。查詢相應蛋白分子量，制備聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫搖床封閉2 h，置于含有一抗稀釋液的抗體孵育盒中4℃過夜，TBST搖床漂洗3次后，加入HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫搖床孵育1 h，TBST搖床漂洗3次后，加入ECL顯色液避光反應2 min，顯影，分析。

2 結(jié)果

2.1 消癌解毒方有效中藥成分的分析。

通過分析消癌解毒方中白花蛇舌草、太子參、山慈菇的有效成分及其化合物，通過口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18的篩選標準，同時去除目前研究中為具有有效報道的成分，共獲得有效化合物13種，其中白花蛇舌草5種，太子參6種，山慈菇2種（表1）。

表1 消癌解毒方組成中藥有效活性成分

2.2 消癌解毒方中有效成分的靶點預測

通過Swiss Target Prediction平臺，在種屬關(guān)系為人類的前提下，共獲得白花蛇舌草對應靶點基因189個，太子參對應靶點87個，山慈菇對應靶點基因54個。

2.3 肝癌對應基因靶點的建立

通過對于肝癌相關(guān)關(guān)鍵詞的檢索，我們從DisGeNET數(shù)據(jù)庫中找到相關(guān)的靶點基因603個，OMIN數(shù)據(jù)庫中共搜索到132個靶點基因，治療靶點數(shù)據(jù)庫TTD中共檢索到17個對應靶點。通過上述三大靶點數(shù)據(jù)庫結(jié)果的整理，排除重復基因以及非人源基因的內(nèi)容，我們共獲得相對應靶點基因651個，與肝癌相關(guān)非編碼RNA 45個。

圖1 1-a消癌解毒方中藥物有效活性成分對應白蛋基因；1-b消癌解毒方中藥物有效靶點基因與疾病肝癌對應靶點的交集

2.4 靶點基因互作網(wǎng)絡的構(gòu)建及其可視化

通過VENN圖的方式，共取得消癌解毒方-肝癌對應靶點基因64個，同時借助Cytoscape軟件可視化分析，得到消癌解毒方中各藥物所對應的靶點。其中白花蛇舌草對應基因59個，太子參對應基因32個，山慈菇對應基因9個，其中3種藥物共同作用的基因有BCL2、CASP8、NCOA2、PTGS2、TGFB1、BAX、CASP3等7個基因（圖1a-b）。

圖2-a白花蛇舌草有效活性成分對應靶點；圖2-b山慈菇有效活性成分對應靶點；圖2-c太子參有效活性成分對應靶點。

圖2 消癌解毒方藥物活性成分對應靶點

2.5 消癌解毒方中藥有效成分與肝癌相關(guān)靶點基因互作關(guān)系

通過本次研究對于消癌解毒方-有效成分對應靶點，消癌解毒方-肝癌對應靶點的數(shù)據(jù)總結(jié)，得出得出白花蛇舌草有效成分2-甲氧基-3-甲基-9，13-蒽醌，豆甾醇，β-谷甾醇，槲皮素對應靶點基因73個，太子參有效成分金合歡素，β-谷甾醇，木犀草素，仙人掌甾醇對應有效靶點43個，山慈菇有效成分β-谷甾醇，豆甾醇對應靶點11個（圖2）。

表2 消癌解毒方對應肝癌有效靶點KEGG富集通路

2.6 消癌解毒方靶點基因的KEGG通路分析

通過對于消癌解毒方與肝癌對應的靶點基因都富集到了與癌癥相關(guān)的的通路上，根據(jù)p值的排序，前23項中與腫瘤直接相關(guān)的通路有10項，包括了肝癌、肺癌、膀胱癌等腫瘤項目。同時又有3條與腫瘤細胞的的代謝凋亡直接相關(guān)的通路，包括癌癥中的蛋白多糖、細胞衰老、PI3K-Akt信號通路、P53信號通路（表2）。同時根據(jù)P<0.05為篩選標準，選區(qū)前10項。

圖3 消癌解毒方中藥物對應疾病有效靶點的GO分析及KEGG可視化分析

2.7 消癌解毒方中藥物對應靶點的GO分析

通過對消癌解毒方中有效藥物對應靶點的GO分析，我們發(fā)現(xiàn)山慈菇的生物功能富集在乳腺形態(tài)發(fā)生、對滲透壓的反應、細胞對滲透壓的反應、淋巴細胞穩(wěn)態(tài)、B細胞穩(wěn)態(tài)、T細胞穩(wěn)態(tài)等相關(guān)功能上（圖4ab）；太子參富集在了T細胞增殖的負調(diào)節(jié)、骨髓白細胞分化的正調(diào)節(jié)、巨噬細胞分化、B細胞穩(wěn)態(tài)、T細胞穩(wěn)態(tài)、細胞質(zhì)模式識別受體信號通路、單核細胞分化等功能方面（圖4c-d）。通過對白花蛇舌草有效靶點的功能富集，我們發(fā)現(xiàn)細胞功能主要分布在細胞對活性氧的反應、消化系統(tǒng)的發(fā)展、上皮細胞凋亡過程、平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖、平滑肌細胞增殖的正調(diào)節(jié)、受體代謝過程、通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄pri-miRNA、通過RNA聚合酶Ⅱ調(diào)節(jié)pri-miRNA轉(zhuǎn)錄、細胞周期等方面（圖5）。

2.8 通過計算各組間細胞的吸光度值，計算各組細胞的細胞活性，低中高劑量組與空白組對比后P<0.05存在統(tǒng)計學意義，同時隨濃度增加，細胞活性隨之降低。

2.9 通過劃痕實驗，空白組的細胞遷移面積明顯高于高劑量組，消癌解毒方中，高劑量組對于細胞的遷移均具有一定的抑制作用。

圖4a-d 太子參，山慈菇有效成分GO生物功能富集；a-b太子參有效生物成分生物功能富集分析；c-d山慈菇有效生物成分生物功能富集分析

2.10 通過流式細胞術(shù)統(tǒng)計各組細胞的凋亡率，空白組細胞凋亡率為15.82%，低劑量組凋亡率17.42%，中劑量組凋亡率18.34%，高劑量組凋亡率19.41%。高劑量組相較空白組具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2.11 通過檢測各組細胞中的Bax，Bcl-2，Cleavedcaspase-3表達量，我們發(fā)現(xiàn)加用消癌解毒方低中高劑量的細胞中Bax含量明顯上升，Bcl-2的表達量減少，Cleaved-caspase-3的表達量也同時上升。同時Bax、Cleaved-caspase-3的表達量存在濃度依賴性，Bcl-2的表達量隨濃度的升高而減少。

圖5 白花蛇舌草有效活性成分功能富集分析

圖6 消癌解毒方低中高劑量對于細胞活性的影響

3 討論

中藥復方“消癌解毒方”是臨床應用實際有效的方劑，該方劑由白花蛇舌草、太子參、山慈菇為君臣主體組構(gòu)成，其在臨床中對于結(jié)直腸癌、肺癌，特別是肝癌的綜合治療具有獨特的療效。

中藥復方是化學體系與病證系統(tǒng)的復雜結(jié)合。借助網(wǎng)絡藥理學“網(wǎng)絡靶標”這一概念與方法[15]，本研究通過分析消癌解毒方中各藥物的有效成分，借助中藥藥理分析平臺（TCMSP）篩選有效成分并按照口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18的篩選標準，并通過PubChem驗證有效成分的活性，同時通過Swiss Target Prediction平臺進行活性成分靶點預測，發(fā)現(xiàn)中藥白花蛇舌草中對應靶點基因73個，太子參對應有效靶點43個，山慈菇對應靶點11個（圖1）。同樣，針對目前臨床對于消癌解毒方應用效果較好的肝癌，本實驗組通過是對肝癌相關(guān)的基因進行了統(tǒng)計分析，借助DisGeNET、人類孟德爾遺傳研究平臺OMIN、PharmGkb三大臨床疾病數(shù)據(jù)庫的靶點分析，與肝癌相關(guān)的共有651個。同時通過映射的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)了中藥復方消癌解毒方可能作用于相關(guān)的64個靶點基因來實現(xiàn)對于肝癌的影響。同時通過對于互作靶點的GO分析以及KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可能通過氧化還原通路、PI3K-Akt信號通路、P53信號通路等多途徑、多通路作用于肝癌細胞，最終實現(xiàn)對于肝癌細胞的殺傷以及促進其凋亡的作用達到臨床治療的效果（圖3）。與此同時，本實驗組同時對于消癌解毒方有效活性成分的生物學功能進行了富集分析，發(fā)現(xiàn)這些功能同時會作用于膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、乙型肝炎、丙型肝炎、癌癥中的蛋白多糖、小細胞肺癌、肝細胞癌、胃癌等多種臨床常見腫瘤，這從分析學角度解釋了臨床消癌解毒方應用于多種腫瘤都能起到一定療效的原因。

圖7 細胞劃痕實驗a:空白組；b:低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組

圖8 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡a:空白組；b:低劑量組；c：中劑量組；d：高劑量組

圖9

同時中藥復方“消癌解毒方”在臨床聯(lián)合化療治療腫瘤時，患者的的化療副作用如惡心嘔吐、咳嗽、失眠等癥狀都明顯優(yōu)于單純化療組[16]。本研究通過對復方中對應活性成分的靶點分析，發(fā)現(xiàn)消癌解毒方中君藥白花蛇舌草的活性成分功能富集多與細胞對活性氧的反應、消化系統(tǒng)的發(fā)展、上皮細胞凋亡過程、平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖、平滑肌細胞增殖的正調(diào)節(jié)、受體代謝過程、通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄pri-miRNA、再生、細胞周期停滯、對dsRNA的反應、成纖維細胞增殖的正調(diào)節(jié)、有絲分裂細胞周期檢查點、細胞周期G1/S相變的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)有絲分裂細胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換等細胞增殖凋亡相關(guān)的功能上（圖5），焦凱賀[17]等通過使用白花蛇舌草提取液能夠在一定程度上誘導胃癌SGC-7091細胞的凋亡；郭洪梅[18]等通過研究白花蛇舌草（BHSSC）水提物對肺癌細胞增殖、凋亡的影響以及體內(nèi)抑制腫瘤活性,同時發(fā)現(xiàn)其對凋亡關(guān)鍵通路MAPK信號通路的影響，從這個角度說明了白花蛇舌草防治腫瘤的作用以及其在復方中君藥的地位。

通過對臣藥太子參的活性成分功能分析發(fā)現(xiàn)，太子參中有效成分能夠在T細胞增殖的負調(diào)節(jié)、骨髓白細胞分化的正調(diào)節(jié)、巨噬細胞分化、B細胞穩(wěn)態(tài)、T細胞穩(wěn)態(tài)、細胞質(zhì)模式識別受體信號通路、含有核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域的信號通路、單核細胞分化、單核細胞分化等免疫應激等方面產(chǎn)生作用，我們有理由相信復方中的太子參可能通過增強免疫通路中的T細胞、B細胞等免疫相關(guān)細胞及細胞因子從而實現(xiàn)對于人體正氣的扶助作用，降低了人體對于治療過程中不良反應的程度（圖4a-b）。褚書豪[19]等通過歸納太子參主要藥理成分發(fā)現(xiàn)，太子參具有心肌保護、增加免疫、抗氧化、降血糖、抗應激、抗疲勞等功效；檀新珠[20]等通過實驗發(fā)現(xiàn)，太子參莖葉多糖能夠不同程度的調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)IgA、IgM、C3含量，從而促進小鼠免疫器官的發(fā)育，增強免疫力。本次研究通過靶點功能層面，證實太子參在復方中確實起到了輔助治療的作用。

對于復方中例外一味中藥山慈菇的研究分析發(fā)現(xiàn)，其活性成分功能在于乳腺形態(tài)發(fā)生、對滲透壓的反應、細胞對滲透壓的反應、淋巴細胞穩(wěn)態(tài)、B細胞穩(wěn)態(tài)、T細胞穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)插入膜中、蛋白質(zhì)插入線粒體膜、線粒體外膜透化、細胞凋亡過程中線粒體膜通透性的正調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)線粒體外膜透化參與凋亡信號通路、線粒體外膜通透的正調(diào)節(jié)涉及凋亡信號通路、蛋白質(zhì)插入線粒體膜參與凋亡信號通路（圖4c-d）。楊雪威[21]等通過山慈菇提取液作用于乳腺癌大鼠腫瘤組織后腫瘤組織中VEGF和MMP-9表達水平發(fā)生了改變，從而對腫瘤產(chǎn)生了抑制作用。牛曉雨[22]等通過使用山慈菇水煎劑作用于人乳腺癌MDA-MB-231細胞，發(fā)現(xiàn)細胞增殖、細胞周期、凋亡和遷移均發(fā)生了顯著變化。修朋程[23]等使用山慈菇提取液作用于H22實體瘤肝癌模型，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中的白細胞介素-2（IL-2）和γ-干擾素（IFN-γ）含量顯著增加，同時與提取液成計量依賴性，證明了山慈菇可能增強小鼠免疫因子達到抗腫瘤的效果。因此我們發(fā)現(xiàn)山慈菇在免疫調(diào)節(jié)方面有著調(diào)節(jié)作用，同時還與細胞凋亡有著密切的關(guān)系。由此山慈菇同樣符合臣藥輔助君藥加強治療主病或主證或是針對兼病或兼證起治療作用的特性。

通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)消癌解毒方作用于肝癌細胞系SMMC-7721后，細胞的活性及遷移能力被抑制，同時增加的了腫瘤細胞的凋亡情況，結(jié)合本次研究的網(wǎng)絡藥理學結(jié)果，我們檢測了消癌解毒方可能作用的BAX、BCL2、CASP3靶點的蛋白表達情況。通過WB技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)，肝癌細胞系SMMC-7721在被消癌解毒方含藥血清作用后，BAX、Cleaved-caspase-3的表達水平明顯上升，Bcl-2的表達水平下降，說明消癌解毒方可能通過促進細胞凋亡的手段從而實現(xiàn)了對于腫瘤的抑制作用，其作用途徑可能是通過影響B(tài)AX、BCL2、CASP3的表達來實現(xiàn)抑制腫瘤的效果，但是其具體的作用效果，還需要我們進一步的實驗研究來證明。

本實驗組在前期對于消癌解毒方的研究過程中得出以下結(jié)果：季漪[24]等發(fā)現(xiàn)消癌解毒方通過抑制AKT/mTOR信號通路激活的自噬，誘導LC3-Ⅱ蛋白表達，降低p62、p-AKT及p-mTOR蛋白表達，可能是其抑制移植瘤生長、促進腫瘤細胞凋亡的機制之一。饒希午[25]等通過蛋白組學的方式發(fā)現(xiàn)消癌解毒方高劑量組差異表達蛋白主要參與了代謝、炎癥反應、免疫調(diào)控、熱休克、氧化應激、細胞周期與凋亡、細胞生長與分化、血管生成、癌相關(guān)、肝再生修復等信號通路等。馬艷霞[26]等發(fā)現(xiàn)消癌解毒方能夠抑制H22荷瘤小鼠移植瘤生長，可通過抑制MMPs相關(guān)蛋白的表達，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)可能是其抗癌機制之一。張玉[27]等發(fā)現(xiàn)消癌解毒方對腫瘤抑制作用可能與其誘導腫瘤細胞凋亡，抑制MMP-2活性有關(guān)。李文婷[28]等發(fā)現(xiàn)消癌解毒方對Walker256大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)及骨髓、胸腺細胞周期有一定的調(diào)節(jié)作用，對淋巴細胞亞群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值及NK細胞活性有一定的調(diào)節(jié)作用，消癌解毒方具有免疫保護作用。姚志華[29]等發(fā)現(xiàn)消癌解毒方可以降低瘤重，具有較好的抑癌效應。消癌解毒方能夠下調(diào)肝臟組織、胸腺和脾臟中Foxp3的表達，抑制調(diào)節(jié)性T細胞的發(fā)育分化及功能的發(fā)揮，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

在本次研究中，借助網(wǎng)絡藥理學手段，發(fā)現(xiàn)中藥復方“消癌解毒方”可能通過NCOA2、BAX、BCL2、PTGS2、CASP3、RELA、TP53等64個靶點基因，作用于細胞增殖、凋亡相關(guān)的信號通路，從而實現(xiàn)抑制多種腫瘤的效果。通過分析消癌解毒方的藥物成分及其功能可知，白花蛇舌草主細胞凋亡，太子參增強免疫系統(tǒng)，山慈菇同時具有促進凋亡及調(diào)節(jié)免疫的功能。通過WB等實驗手段發(fā)現(xiàn)消癌解毒方確實通過作用BAX、BCL2、CASP3等靶點實現(xiàn)抑制腫瘤生長的目的。結(jié)合本實驗組的研究成果，消癌解毒方確實在抑制腫瘤生長，提高患者的免疫功能上具有一定的作用。這于本次的網(wǎng)絡藥理學預測結(jié)果形成相互呼應。

綜合上述研究，通過網(wǎng)絡藥理學手段，我們首次從現(xiàn)代生物學的角度解釋了消癌解毒方中君藥，臣藥組成的合理性，科學性。為中醫(yī)藥復方抗腫瘤提供理論支持，為后續(xù)研究做鋪墊。