吉林人參低聚肽對(duì)小鼠耐缺氧作用的研究

任金威，李 迪，孫靖琴，劉欣然，張召鋒，王軍波，李 勇

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，不僅會(huì)影響機(jī)體內(nèi)神經(jīng)、消化、呼吸、泌尿、內(nèi)分泌等各個(gè)系統(tǒng)的生理功能，還會(huì)影響機(jī)體內(nèi)碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、水和電解質(zhì)等各種物質(zhì)的代謝過(guò)程，嚴(yán)重危害生物體的健康[1-3]。其具體癥狀一般包括心跳加快、口干，進(jìn)一步可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、心悸、呼吸短促，更甚者出現(xiàn)全身乏力、昏迷、休克等[3-4]。因此，尋求安全有效的防治缺氧的措施，以減少缺氧及相關(guān)疾病的發(fā)生，具有重要的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)意義。在很長(zhǎng)的一段時(shí)期內(nèi)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于耐缺氧的研究主要集中在尋找預(yù)防和治療缺氧的藥物上。近年來(lái)，學(xué)者們的研究目光開(kāi)始轉(zhuǎn)向食品領(lǐng)域，已有大量研究證實(shí)，天然食物成分在改善缺氧方面是安全有效的。

生物活性肽(BAP)是指對(duì)生物機(jī)體的生命活動(dòng)有益或具有生理作用的肽類化合物[5]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)低聚肽的吸收和代謝速度比對(duì)游離氨基酸快[6]。另外，BAP類具有廣泛的生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓、降膽固醇、抗氧化和清除自由基作用等。目前BAP以其高效、安全的特點(diǎn)異軍突起，逐漸顯示出其在臨床營(yíng)養(yǎng)中的重要作用和廣泛的應(yīng)用前景[5]。

2012年9月4日，中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)人參成為新資源食品，人參的應(yīng)用將由單一的中藥材拓展到食品、飲料及保健產(chǎn)品等領(lǐng)域，范圍大幅擴(kuò)大，這為我國(guó)的人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了新的契機(jī)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，人參具有顯著的耐缺氧作用[8-9]。對(duì)人參提取物人參皂苷的研究也表明，人參皂苷rgl[10]、Rb1[11-12]等均有改善缺氧耐受力的作用。

人參低聚肽雖然作為一類重要的化合物存在于人參組織中，但其功能研究較少報(bào)道。低聚肽在人體內(nèi)不需消化可直接吸收，比單個(gè)氨基酸吸收更有效，可直接參與蛋白質(zhì)的合成[5]，可避免活性物質(zhì)的浪費(fèi)，大大提高其生理調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)和急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)，觀察吉林人參低聚肽(ginseng oligopeptides，GOP)水溶液的耐缺氧效果，為缺氧的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)和GOP功能性食品開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

健康SPF級(jí)成年雄性BALB/C小鼠180只，適應(yīng)期結(jié)束時(shí)，體重18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2011-0012。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食、飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室符合國(guó)標(biāo)清潔級(jí)，溫度范圍為22±2℃，相對(duì)濕度為50%～60%，晝∶ 夜明暗交替時(shí)間為12h∶ 12h。

GOP，淡黃色固體粉末，利用生物酶解技術(shù)從吉林人參中分離得到的小分子生物活性肽的混合物，混合物主要以小分子低聚肽為主，分子量小于1 000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.42%，吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司；鈉石灰，AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉，AR，重慶百倍精細(xì)化工廠；凡士林。

1.2 儀器與設(shè)備

AdventurerTM通用型分析天平，美國(guó)奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn) 取60只BALB/C小鼠，按體重隨機(jī)分成6組，每組10只。實(shí)驗(yàn)設(shè)立4個(gè)GOP劑量組[0.075、0.150、0.300、0.600g/(kg·BW)]、1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)乳清蛋白組[0.300g/(kg·BW)]。分組后，4個(gè)劑量組每天灌胃給予不同濃度的GOP水溶液，空白對(duì)照組每日灌胃給予同體積的蒸餾水，乳清蛋白組給予同體積乳清蛋白水溶液。灌胃量為1mL/100g，每日1次。乳清蛋白水溶液和GOP水溶液均用蒸餾水配制。所有的動(dòng)物每周均稱量體重1次，按體重水平調(diào)整灌胃量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)最后1次稱重。每日觀察小鼠的食欲行為、狀態(tài)、毛發(fā)及動(dòng)物死亡情況。連續(xù)灌胃干預(yù)30d。在動(dòng)物末次灌胃后1h，將各組動(dòng)物放入250mL磨口瓶?jī)?nèi)(瓶?jī)?nèi)盛有5g鈉石灰)，每瓶1只，用凡士林密封瓶口，保證不漏氣。立即計(jì)時(shí)，記錄小鼠因缺氧而停止呼吸的時(shí)間。

1.3.2亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物分組及干預(yù)方法同1.3.1，在動(dòng)物末次灌胃后1h，各組動(dòng)物腹腔注射亞硝酸鈉溶液，注射劑量為240mg/(kg·BW)，注射量為0.1mL/10g。立即計(jì)時(shí)，記錄小鼠存活時(shí)間。

1.3.3急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物分組及干預(yù)方法同1.3.1，在動(dòng)物末次灌胃后1h，各組小鼠逐只自頸部斷頭，立即按下秒表，記錄動(dòng)物自斷頭后至張口喘氣停止的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 GOP對(duì)小鼠常壓缺氧存活時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，乳清蛋白組及人參肽A、B、C、D劑量組常壓耐缺氧存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，延長(zhǎng)率分別為8.8%、24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽A、B、C、D劑量組小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1人參肽對(duì)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間的影響

組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時(shí)間(min)延長(zhǎng)率(%)空白對(duì)照組10036.67±3.86—乳清蛋白組100.15039.91±3.998.8人參肽A劑量組100.07545.66±3.49ab24.5人參肽B劑量組100.15051.89±3.06ab41.5人參肽C劑量組100.30054.03±4.05ab47.3人參肽D劑量組100.60056.42±8.23ab53.8

注：a與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

2.2 GOP對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒所致缺氧存活時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組相比，人參肽B、C、D劑量組存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，延長(zhǎng)率分別為23.6%、41.4%、45.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽C、D劑量組存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)，上述差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表2人參肽對(duì)小鼠亞硝酸鈉中毒所致缺氧存活時(shí)間的影響

組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時(shí)間(min)延長(zhǎng)率(%)空白對(duì)照組10018.56±1.37—乳清蛋白組100.15021.44±2.3215.5人參肽A劑量組100.07521.46±1.2915.6人參肽B劑量組100.15022.94±5.19a23.6人參肽C劑量組100.30026.25±4.92ab41.4人參肽D劑量組100.60027.08±5.73ab45.9

注：a與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

2.3 GOP對(duì)小鼠急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組相比，人參肽A、B、C、D劑量組存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，延長(zhǎng)率分別為4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與乳清蛋白組比較，人參肽B、C、D劑量組存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3人參肽對(duì)小鼠急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間的影響

組別動(dòng)物數(shù)(只)劑量[g/(kg·BW)]存活時(shí)間(min)延長(zhǎng)率(%)空白對(duì)照組10020.00±0.67—乳清蛋白組100.15020.10±0.880.5人參肽A劑量組100.07520.90±0.88a4.5人參肽B劑量組100.15022.20±0.92ab11.0人參肽C劑量組100.30022.20±1.48ab11.0人參肽D劑量組100.60021.80±0.92ab9.0

注：a與空白對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；b與乳清蛋白組比較差異有顯著性(P<0.05)

3 討論

氧是維持正常生命活動(dòng)所必需的物質(zhì)。缺氧是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程，是導(dǎo)致病人死亡的重要原因之一[13]。一般來(lái)說(shuō)，輕度缺氧主要引起機(jī)體的代償反應(yīng)，而嚴(yán)重缺氧則可導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外呼吸和循環(huán)等主要系統(tǒng)功能障礙甚而功能衰竭[14]。因此，尋找有效的耐缺氧藥物，減少缺氧的危害，對(duì)人類的健康有著十分重要的意義。

單純的蛋白質(zhì)攝入增加可能會(huì)對(duì)耐缺氧功能有一定的影響，乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時(shí)保留在上清液中的多種蛋白質(zhì)組分的統(tǒng)稱，其在消化過(guò)程中產(chǎn)生多種生物活性多肽，具有提高免疫力、抗疲勞、抗氧化、耐缺氧等多種功效[15]。因此，為了排除因單純?cè)黾拥鞍踪|(zhì)的攝入而引起的假陽(yáng)性結(jié)果，本研究另設(shè)了乳清蛋白組作為對(duì)照組。本研究顯示，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組和乳清蛋白組相比，GOP均可明顯延長(zhǎng)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時(shí)間和急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間。

常壓密閉環(huán)境下，由于供氧不足，導(dǎo)致動(dòng)脈血氧含量減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧分壓嚴(yán)重降低，致使線粒體用氧障礙而影響機(jī)體能量代謝。本研究顯示，與空白對(duì)照組相比，人參肽各劑量組常壓耐缺氧存活時(shí)間分別延長(zhǎng)了24.5%、41.5%、47.3%和53.8%，乳清蛋白組延長(zhǎng)了8.8%，說(shuō)明人參肽可提高小鼠常壓耐缺氧功能，且效果優(yōu)于乳清蛋白。這可能與人參肽能夠提高小鼠血氧飽和度和減少機(jī)體耗氧量有關(guān)。

亞硝酸鈉中毒是由于亞硝酸鈉使正常二價(jià)鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧死亡[16]。本研究顯示，人參肽B、C、D劑量組亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間較空白對(duì)照組分別延長(zhǎng)了23.6%、41.4%和45.9%，而乳清蛋白組存活時(shí)間無(wú)顯著增長(zhǎng)，提示人參肽可改善小鼠亞硝酸鈉中毒導(dǎo)致的缺氧狀況，而乳清蛋白暫未顯示此作用。推測(cè)人參肽可能通過(guò)緩解小鼠細(xì)胞外液的缺氧狀況，提高小鼠細(xì)胞對(duì)氧的利用效率，增加血紅蛋白的含量，從而延長(zhǎng)小鼠缺氧的存活時(shí)間。另一方面，該作用也可能與人參肽具有抗氧化作用有關(guān)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究和探討。

小鼠自頸部斷頭后，大腦雖供血終止，但腦中原有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和血液尚能夠暫時(shí)維持大腦功能，從而使小鼠可以有規(guī)律地張口喘氣。觀察動(dòng)物自斷頭后至張口喘氣停止的時(shí)間，可以評(píng)價(jià)人參肽對(duì)急性腦缺血性缺氧的保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，人參肽各劑量組急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間分別延長(zhǎng)了4.5%、11.0%、11.0%和9.0%，而乳清蛋白組存活時(shí)間延長(zhǎng)不顯著。提示人參肽可以緩解小鼠急性腦缺血性缺氧，而乳清蛋白無(wú)此作用。這可能與人參肽增強(qiáng)了神經(jīng)細(xì)胞的耐缺氧能力有關(guān)。

本研究表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與空白對(duì)照組比較，人參肽4個(gè)劑量組常壓耐缺氧存活時(shí)間和急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)；除A劑量組外，其余各組亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。與乳清蛋白組相比，人參肽4個(gè)劑量組常壓耐缺氧存活時(shí)間均顯著延長(zhǎng)；C、D劑量組亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)；B、C、D劑量組急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GOP能延長(zhǎng)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時(shí)間和急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、亞硝酸鈉中毒存活實(shí)驗(yàn)和急性腦缺血性缺氧實(shí)驗(yàn)，設(shè)立空白對(duì)照組和乳清蛋白組作為對(duì)照組，探討GOP對(duì)小鼠耐缺氧作用的影響。結(jié)果提示，GOP能延長(zhǎng)小鼠常壓耐缺氧存活時(shí)間、亞硝酸鈉所致缺氧存活時(shí)間和急性腦缺血性缺氧存活時(shí)間，表明GOP具有耐缺氧作用，具備作為一種新型耐缺氧制劑的潛力，有關(guān)其耐缺氧作用的深層機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究與探討?！?/p>