豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏性試驗

王宇慧，李昕，孫曉莉，孟佳麗，尚翠玲，林靜，金天明

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豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及藥敏性試驗

王宇慧，李昕，孫曉莉，孟佳麗，尚翠玲，林靜，金天明通信作者

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

以天津某大型豬場病死青年豬為研究對象，綜合豬只臟器病變狀況觀察，以及形態(tài)學鑒定、培養(yǎng)基鑒定、生化鑒定和16S rRNA擴增PCR鑒定等4種方法，并通過動物致病性試驗驗證，結果顯示，該發(fā)病豬為豬胸膜肺炎放線桿菌（，APP）感染。藥敏試驗結果顯示，豬胸膜肺炎放線桿菌對頭孢哌酮敏感；對氯霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星為中度敏感；對強力霉素、鏈霉素、卡那霉素、青霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、萬古霉素、慶大霉素耐藥。本試驗為豬場豬胸膜肺炎的臨床診斷及用藥提供了理論依據。

豬胸膜肺炎放線桿菌；16S rRNA；分離鑒定；藥敏試驗

胸膜肺炎放線桿菌（，APP）是豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious pleuropneumonia，PCP）的致病菌，為革蘭氏陰性小球桿菌[1-3]，主要寄生在呼吸道，隨空氣傳播入肺，引發(fā)疾病，致死率可高達80%以上[4-5]。

豬傳染性胸膜肺炎不分年齡階段，各性別豬均易感染，常爆發(fā)于1～3月齡仔豬[6-9]，自1957年由Pattison等首次報道以來，呈世界流行性趨勢，集約化養(yǎng)殖國家尤甚嚴重，屬集約化養(yǎng)殖廠五大疫病之一[10-11]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

2017年天津某大型豬場陸續(xù)發(fā)生豬只死亡，學校實驗室接收送檢3只病死青年豬（1號豬30日齡，2號豬58日齡，3號豬80日齡）。

1.1.2 主要儀器試劑

正倒置一體顯微鏡（Echo Laboratories），CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司），恒溫搖床（上海世平實驗設備有限公司），PCR擴增儀（北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司），電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。

TSB肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨大豆肉湯，酵母粉，大豆蛋白胨，葡萄糖，NaCl，K2HPO4·H2O，NAD＋，5%血清），TSA瓊脂平板（同TSB肉湯培養(yǎng)基，Agar Power），革蘭氏染色劑（批號：20170526），血瓊脂平板培養(yǎng)基，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇蔗糖水溶液，Dunham氏蛋白胨水溶液，Ehrlich氏試劑，戊醇，二甲苯，甲基紅試劑，VP試劑（使用前均加入NAD＋），H2S微量發(fā)酵管，Buffer，MgCI2，dNTP，引物16S rRNA，酶，藥敏紙片。

1.1.3 PCR引物（通用引物16S rRNA）

使用16S rRNA基因的通用引物對目標片段進行擴增，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。按照使用說明進行稀釋分裝，-20 ℃保存。引物具體見表1。

表1 PCR引物

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離

對病豬進行剖檢，采集心、肝、脾、肺、腎、心包液、腹腔液、下頜淋巴結、胃、腸等病變部位病料，接種于TSA瓊脂平板上，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察菌落形態(tài)，并挑取不同形態(tài)菌落分離培養(yǎng)。將純化后的細菌接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、三糖鐵斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結果。將純化并鑒別后的菌種接種于TSB肉湯培養(yǎng)基，恒溫搖床上170 r/min 37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌種凍干保存。

1.2.2 革蘭氏染色鏡檢

將純化后的菌種進行革蘭氏染色，應用光學顯微鏡，100倍物鏡下進行油鏡鏡檢觀察并拍照記錄。

1.2.3 生化鑒定

乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖水溶液試管中放入倒置的杜氏小管，分別接種分離純化后的菌種培養(yǎng)液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培育2～3 d，觀察培養(yǎng)結果[8]。同時進行吲哚（靛基質）試驗、甲基紅（MR）/VP試驗、H2S試驗鑒定，觀察并記錄試驗結果。

1.2.4 PCR鑒定

將分離純化后的菌種接種到TSB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。利用16S rRNA引物擴增細菌基因序列。PCR反應體系為：5.0 μL 菌液、1.0 μL PF、1.0 μL PR、12.5 μL 2×PCR Master Mix，ddH2O定容至25 μL。反應條件為：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸15 min[12-13]。PCR反應結束后，取5 μL PCR產物與1 μL上樣緩沖液混勻，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的條帶。

將PCR產物送上海生工生物工程公司測序并用NCBI/BLAST分析測序結果。

1.2.5 動物致病性試驗

將分離純化細菌單個菌落用生理鹽水作5倍和10倍稀釋，取15～20 g小鼠分成3組，每組2只。第1組為試驗組，腹腔接種5倍稀釋的菌液0.2 mL；第2組為實驗組，腹腔接種10倍稀釋的菌液0.2 mL；第3組作為對照組，腹腔注射生理鹽水0.2 mL，觀察各組小鼠發(fā)病情況。待小鼠死后，剖檢，記錄病理變化，取內臟病料依據以上方法進行細菌分離培養(yǎng)，進行革蘭氏染色鏡檢、培養(yǎng)基鑒定、生化鑒定等。

1.2.6 藥敏試驗

將對數生長期的致病菌菌液稀釋至1×108～2×108cfu/mL，用移液器吸取菌液0.1 mL涂布于TSA瓊脂平板，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈直徑大小并記錄。

2 結果與分析

2.1 剖檢結果

對3只病死豬進行剖檢發(fā)現，豬肺部大量出血，肺部與胸部黏連，分離下來的肺不完整，可能與胸膜的纖維素性黏連有關（圖1、圖2）。

圖1 胸腔解剖圖

圖2 肺臟解剖圖

2.2 形態(tài)學檢查結果

經過革蘭氏染色，肺（1-1）、肺（1-3）、肺（2-3）、胃（1-3）、胃（2-1）、胃（2-3）、胃（2-2）、胃（2-2）、胃（2-3）、胃（2-2）、心包液（3）、心（1-2）、肝（1-1）、右腎（1-1）、右腎（1-2）、腸（1-4）和腹腔液分離到不同染色形態(tài)的細菌。其中肺（1-1）、肺（2-3）、心包液（3）雖眼觀形態(tài)略有不同，但是都是革蘭氏陰性小球狀桿菌，如圖3～圖5所示。

圖3 肺（1-1）

圖4 肺（2-3）

圖5 心包液（3）

2.3 培養(yǎng)特性結果

細菌培養(yǎng)發(fā)現肺（1-1）、肺（2-3）在TSA瓊脂平板上正常生長，形成濕潤、灰白色、隆起的小圓形菌落；在血平板上有β-溶血環(huán)；在TSB肉湯培養(yǎng)基中呈均勻混濁。

2.4 生化鑒定結果

果糖、葡萄糖、麥芽糖生化試驗培養(yǎng)液顏色轉變，但杜氏小管中并未出現氣體，而乳糖、甘露醇、蔗糖培養(yǎng)液顏色沒有變化，杜氏小管中也沒有出現氣體；吲哚（靛基質）生化試驗結果為陰性；MR試驗培養(yǎng)液始終為黃色，VP試驗培養(yǎng)液顏色未變；H2S試驗培養(yǎng)液為無色，試驗結果見表2。

表2 部分菌珠生化鑒定結果

注：“＋”表示90%～100%陽性；“-”表示0%～10%陽性

2.5 PCR鑒定結果

2.5.1 PCR對分離株的電泳檢測

相應編號細菌經過PCR擴增出約1 540 bp的條帶，如圖6、圖7所示。

圖6 基因PCR擴增圖

注：M為DNA marker（DL-2000）；1為肺（1-1）；2為肺（1-3）；3為肺（2-3）；4為胃（1-3）；5為胃（2-1）；6為胃（2-3）；7為胃（2-2）；8為胃（2-2）

圖7 基因PCR擴增圖

注：M為DNA marker（DL-2000）；1為胃（2-3）；2為胃（2-2）；3為心包液（3）；4為心（1-2）；5為肝（1-1）；6為右腎（1-1）；7為右腎（1-2）；8為腸（1-4）；9為腹腔液

2.5.2 PCR對分離株的基因序列檢測

測序結果發(fā)現，肺（1-1）、肺（2-3）分離株16S rRNA基因序列測序結果相同，且與序列號為D30032.1的16S rRNA基因序列同源率高達98%，因此可確定該菌種為豬胸膜肺炎放線桿菌。

2.6 動物致病性試驗結果

第1組（試驗組）小鼠在接種后2 h，精神沉郁，食欲廢絕。6只小鼠在8～48 h內先后死亡，剖檢所見病理變化為肺臟出血，與胸膜有纖維素樣黏連，支氣管與腸系膜淋巴結發(fā)生水腫。對照組無發(fā)病或死亡。

解剖小鼠后，取病變臟器染色鏡檢，并同時進行細菌分離培養(yǎng)，染色鏡檢，培養(yǎng)性狀觀察，生化試驗等。其菌的特征與病料中分離的一致。染色鏡檢如圖8、圖9所示。

圖8 肺（1-3）

圖9 肺（2-2）

2.7 藥敏試驗結果

研究結果發(fā)現，胸膜肺炎放線桿菌對頭孢哌酮敏感；對氯霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星為中度敏感；對強力霉素、鏈霉素、卡那霉素、青霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、萬古霉素、慶大霉素耐藥。試驗結果見表3。

表3 致病性胸膜肺炎放線桿菌的耐藥性情況（抑菌圈） mm

注：判定標準為2r＜12，耐藥（R）；12≤2r≤16 ，中敏（I）；2r＞16 ，敏感（S）

3 討論

豬胸膜肺炎放線桿菌為革蘭氏陰性小球桿菌，常寄生于呼吸道中，可隨空氣流動，釋放的毒素直接破壞機體免疫細胞、血細胞，到達肺臟引發(fā)疾病。豬胸膜肺炎放線桿菌感染病死豬肺部水腫、出血、壞死和纖維素化；胸腔出現纖維素樣滲出物；心部發(fā)炎；漿膜表面有許多滲出物和纖維素的沉積[14-16]。若有類似癥狀，可初步懷疑病豬感染豬胸膜肺炎放線桿菌。剖檢豬胸膜肺炎放線桿菌感染病死豬會發(fā)現肺部出血、不完整，可能與胸膜的纖維素性黏連有關，初步懷疑病豬感染胸膜肺炎放線桿菌。

本研究中，抹片染色鏡檢觀察臟器細菌形態(tài)，發(fā)現細菌為革蘭氏陰性小球狀桿菌。培養(yǎng)基鑒定發(fā)現細菌在TSA瓊脂平板上長出濕潤、小圓形隆起菌落；在TSB肉湯培養(yǎng)基中呈均勻渾濁；因其有毒力因子如莢膜、脂多糖、外膜蛋白、黏附素和Apx毒素等[17]，可直接破壞血細胞，在血平板上面有β-溶血現象。豬胸膜肺炎放線桿菌標準生化特性為：糖類分解試驗中，乳糖顯陰性、果糖顯陽性、葡萄糖顯陽性、麥芽糖顯陽性、甘露醇顯陰性、蔗糖顯陰性；吲哚（靛基質）試驗顯陰性；甲基紅（MR）試驗顯陰性、VP試驗顯陰性；H2S試驗顯陽性。生化鑒定結果表明，細菌生理代謝特點與胸膜肺炎放線桿菌相符。對該菌株的16S rRNA基因片段進行序列測定，經NCBI/Blast數據庫比對分析，該菌株與豬胸膜肺炎放線桿菌16S rRNA基因序列相似性高達98%。動物致病性試驗發(fā)現，小鼠臟器分離細菌與病料中細菌形態(tài)學檢查、培養(yǎng)基鑒定以及生化鑒定試驗結果一致，確定豬只死亡致病菌為胸膜肺炎放線桿菌。

4 結論

綜合豬只臟器病變狀況觀察，以及形態(tài)學鑒定、培養(yǎng)基鑒定、生化鑒定和16S rRNA擴增PCR鑒定結果，得出豬胸膜肺炎放線桿菌為疑似致病菌；動物致病性試驗確定病死青年豬死因為豬胸膜肺炎放線桿菌感染。

藥敏試驗發(fā)現胸膜肺炎放線桿菌對頭孢哌酮敏感；對氯霉素、阿莫西林，環(huán)丙沙星敏感性中等；對強力霉素、鏈霉素、卡那霉素、青霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、萬古霉素、慶大霉素耐藥。

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責任編輯：張愛婷

The isolation and identification of pathogen and drug susceptibility test for

WANG Yu-hui, LI Xin, SUN Xiao-li, MENG Jia-li, SHANG Cui-ling, LIN Jing, JIN Tian-mingCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In this study, three young pigs in a large pig farm from Tianjin were selected as the research objects. The results of the pathological changes of the organs, the isolation and identification of morphology, the culture medium, the biochemistry, 16S rRNA amplification and PCR were carried out to identify pathogenic bacteria. The bacteria were identified as pathogenic bacteria by animal pathogenicity test. The results showed that the cause of swine’s death wasThen drug sensitivity test showed that APP was sensitive to cefoperazone; moderately sensitive to chloramphenicol, amoxicillin and ciprofloxacin; and resistantto doxycycline, streptomycin, kanamycin, penicillin, tetracycline, ampicillin, vancomycin, and gentamicin. This experiment provides a theoretical basis for the clinical diagnosis and medication of APP.

; 16S rRNA; isolation and identification; drug sensitivity test

1008-5394（2018）04-0033-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.008

P641.131；S152.72

A

2018-06-06

天津市農委農業(yè)科技示范推廣項目（201601380）；天津市科技計劃項目（高端獸藥先進制造科技重大專項）（17ZXGSNC00030）；大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201710061107）

王宇慧（1996-），女，本科在讀，主要從事動物醫(yī)學方面研究。E-mail：18322102589@139.com。

金天明（1968-），男，教授，博士，主要從事獸醫(yī)分子免疫學研究。E-mail：jtm680@163.com。