芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應和細胞凋亡的影響

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心肌缺血再灌注誘導的損傷是急性心肌梗死溶栓和介入治療中經常伴隨的一種病理損傷[1-2]。芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注損傷有保護作用。據研究顯示，芪參益氣滴丸可增加缺血心臟組織的能量代謝物質三磷酸腺苷(ATP)的含量，從而改善腦缺血后發(fā)生的能量代謝障礙[3]。芪參益氣滴丸可以減少心肌細胞凋亡，抑制炎癥反應發(fā)生，間接保護心肌缺血再灌注損傷。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷模型，研究芪參益氣滴丸對心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應和細胞凋亡的保護作用，以期為進一步深入研究提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取雄性大鼠120只，體質量為(199.2±23.2)g，購于本直屬大學實驗動物中心。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白及酶基質膠與Mdivi-1(美國Sigma公司)；白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(上海玉博生物科技有限公司提供)；芪參益氣滴丸購于天士力制藥集團股份有限公司(國藥準字Z200330139，規(guī)格為5 g，用于試驗組的使用)。

1.2 實驗方法

1.2.1 內皮細胞的培養(yǎng)和鑒定[4]選取培育成熟的雄性大鼠進行內皮細胞培養(yǎng)試驗。首先采用腹腔注射的方式將3 g/L戊巴比妥鈉進行注射麻醉后，于無菌條件下取出試驗大鼠的左心室，注意將其放于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)試管中，沖洗干凈；然后剪碎心肌組織，加入75%乙醇滅活30 s，加入等體積的2.5 g/L的Ⅱ型膠原酶后，37 ℃水浴中消化反應5 min。結束后加入等體積2.0 g/L胰蛋白酶進行反應，相同溫度條件下消化反應10 min，然后加入等體積含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行中和反應，將此反應終止。靜置，離心，棄上清液，將細胞重新完全懸在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)皿上進行接種，37 ℃溫度，2%二氧化碳孵化箱中恒溫培養(yǎng)6 h。收集細胞，取第2代、第3代的細胞用于實驗。

1.2.2 血管環(huán)試驗 大鼠用木槌擊暈后行頸部脫臼，打開胸腔，迅速取出胸主動脈條上段，置于4 ℃的K11溶液中。小心剔除其周圍結締組織后，將血管剪成3 mm長的主動脈環(huán)，迅速懸掛至5 mL離體灌流裝置中。然后按照1.2.1的操作步驟操作。

1.2.3 建立缺血/再灌注模型[5]大鼠稱重后進行麻醉，將其仰臥并固定于手術臺上，建立缺血/再灌注模型試驗。首先建立模擬缺血，采用純氮氣持續(xù)通氣，時間為40 min，測定血氧分壓小于40 kPa即為模擬缺血。采用純氧氣持續(xù)通氣大于40 min，即為模擬再灌注；或也可以采用缺血液培養(yǎng)液建立模擬缺血，缺血液培養(yǎng)液配制按照參考文獻[6]進行配制，pH=6.5，37 ℃缺氧孵箱內孵育2 h，即為模擬缺血。更換正常培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2孵箱內孵育4 h即為模擬再灌注。

1.2.4 試驗分組 120只大鼠分為對照組、缺血/再灌注模型組、試驗組，每組40只。試驗組和缺血/再灌注模型組大鼠按“1.2.3”建立的缺血/再灌注模型進行建模，缺血2 h，再灌注4 h，再灌液10 g。試驗組給予5 g芪參益氣滴丸，缺血/再灌注模型組給予生理鹽水；對照組不做任何處理。芪參益氣滴丸5 g可以達到最佳的效果[7]。

1.2.5 人體試驗 選取有心血管疾病的病人2例，按照缺血/再灌注誘導的心肌微血管內皮細胞試驗組實驗操作進行人體試驗，觀察細胞情況。

1.3 觀察指標

1.3.1 MTT比色法測定心肌細胞活性[6]取同一批分離的心肌細胞，接種后進行復氧處理1 h。復氧結束后，加20 μL的 MTT培養(yǎng)液進行培養(yǎng)4 h，待結晶物被溶解后采用酶標儀進行測定，在波長490 nm處檢測各組的吸光度(A)值作為心肌細胞活性。

1.3.2 TUNEL法檢測心肌細胞的細胞凋亡率[8]收集心肌活細胞，按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。在熒光顯微鏡下進行觀察，顯示綠色熒光為細胞凋亡。采用DAPI對采集的細胞核進行染色，對每張呈現藍色熒光的圖選取10個視野計數，計數為80個視野，統(tǒng)計內皮細胞總數和凋亡細胞數。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞數×100%。

1.3.3 放射免疫法檢測炎癥因子 采集3組大鼠的心肌血3 mL，嚴格按照IL-6、TNF-α試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.1 各組細胞增殖活性比較 與對照組比較，缺血/再灌注模型組、試驗組細胞增殖能力明顯降低；試驗組與缺血/再灌注模型組比較，試驗組細胞增殖能力明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 各組細胞增殖活性比較

2.2 各組心肌細胞的凋亡率比較 與對照組比較，缺血/再灌注模型組、試驗組細胞凋亡率明顯增加；與缺血/再灌注模型組比較，試驗組細胞凋亡率明顯降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組心肌細胞的凋亡率比較(±s)

2.3 各組炎癥因子表達能力比較 與對照組比較，缺血/再灌注模型組IL-6水平表達明顯升高，TNF-α明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與缺血/再灌注模型組比較，試驗組IL-6表達明顯降低，TNF-α表達明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組IL-6、TNF-α的比較(±s)

3 討 論

急性心肌梗死是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，其斑塊的形成是個復雜的過程。采用不同的藥物治療可以減少心肌微血管內皮細胞損傷，芪參益氣滴丸對心肌微血管內皮細胞損傷具有保護功效。

缺血性心肌細胞損傷主要以心肌細胞壞死和細胞凋亡兩種細胞死亡形式存在[9]。因此將細胞凋亡作為重要指標對缺血性心肌細胞損傷進行分析，可以反映心肌組織的情況，而心肌細胞凋亡受到多種基因與蛋白調控[10]。通過細胞活性和凋亡的研究可以判定不同藥物對缺血性心肌損傷的作用，從而為進一步治療提供可靠依據。黃芪甲苷、丹參素、原兒茶醛、人參皂苷作為芪參益氣滴丸中的重要成分，對人體的大腦、心臟、腎臟等重要器官的缺血損傷起到抑制作用。據研究報道顯示，采用芪參益氣滴丸可以增加缺血性心肌細胞損傷的細胞凋亡，減少細胞增殖活性[11]。本研究結果也支持此論斷，芪參益氣滴丸可以對缺血/再灌注誘導的心肌微血管內皮細胞損傷起到保護作用。

芪參益氣滴丸除了抗疲勞、抗輻射、抑制炎癥反應等功效外，更多的研究顯示其對細胞的損傷有保護抑制作用。其主要原因是芪參益氣滴丸參與了細胞中相關蛋白的反應[12]。也有研究顯示芪參益氣滴丸可以增加心肌細胞中各種蛋白的表達，芪參益氣滴丸的適量添加，提高了心肌缺血后心肌組織對氧化應激損傷的保護作用[13]。

炎癥反應在心力衰竭發(fā)生時刺激心肌細胞產生促炎癥細胞因子，心肌局部促炎癥細胞因子生成的重要來源主要是心肌細胞、心肌成纖維細胞，最為重要的是中性粒細胞和巨噬細胞[14]。發(fā)生心力衰竭與IL-6、TNF-α的濃度水平密切相關[15]，因此本研究將IL-6、TNF-α作為重要指標進行分析。結果顯示芪參益氣滴丸可以有效降低IL-6、TNF-α水平，起到抗炎癥的作用。

本研究通過建立缺血再灌注損傷模型，對試驗組、缺血/再灌注模型組與對照組進行比較，結果發(fā)現芪參益氣滴丸可以降低細胞增殖能力，增加細胞凋亡率能力，增加IL-6、TNF-α表達能力，減少心肌缺血后心臟組織的損傷，從而起到對缺血再灌注誘導的心肌微血管內皮細胞損傷的保護作用。芪參益氣滴丸可減輕缺血再灌注的心肌細胞損傷，主要通過抗炎和抗細胞凋亡途徑來實現保護作用。