HS-GC-MS分析不同影響因素對砂仁揮發(fā)油主要成分的影響△

李婧琳，王媚，邰佳，齊菲，鄒俊波，張小飛，崔春利，張琴，史亞軍

(陜西中醫(yī)藥大學/陜西省中醫(yī)藥管理局中藥制藥工程重點學科/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712046)

中藥揮發(fā)油是中藥中一類重要的活性物質(zhì)，現(xiàn)代藥理研究表明，揮發(fā)油具有殺蟲、抑菌、消炎、抗腫瘤等作用，在中藥研究中具有重要的地位[1]。但揮發(fā)油穩(wěn)定性差，在制備與儲存過程中易受到外界環(huán)境的影響而揮散、氧化、變質(zhì)等，影響制劑的安全性及有效性[2]，現(xiàn)今對復方中揮發(fā)油質(zhì)量控制也未見報道。為提高揮發(fā)性成分保留量，改善制劑品質(zhì)，現(xiàn)有的處理方式是將揮發(fā)油經(jīng)環(huán)糊精包和、微囊化等處理后加入復方中[3]，這樣雖然能提高相關(guān)揮發(fā)油含量，但不適合工業(yè)大生產(chǎn)，且包合物質(zhì)量不易控制[4]、在制備過程中不可避免會剔除一些成分，打破了原有配伍間可能存在的相互作用。

砂仁為姜科植物陽春砂AmomumvillosumLour.、綠殼砂AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Eenjen 或海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu 的干燥成熟果實[5]。其主要成分為揮發(fā)油，陽春砂揮發(fā)性成分中乙酸龍腦酯含量最高，樟腦次之，而綠殼砂中樟腦含量最高，乙酸龍腦酯次之[6]。砂仁在中醫(yī)治療胃病中有著非常明確的藥用價值，現(xiàn)代藥理研究表明，砂仁還具有降脂、降血糖、鎮(zhèn)痛、消炎、止瀉等作用，其中樟腦、乙酸龍腦酯等成分與砂仁鎮(zhèn)痛藥效有較高的關(guān)聯(lián)度[7]，這可能是砂仁行氣止痛、溫脾止瀉的物質(zhì)基礎(chǔ)。2015版《中華人民共和國藥典》中，有62味成方制劑中含有砂仁，以細粉形式入藥的占85%，因揮發(fā)性成分含量的高低會直接影響砂仁的藥效，進一步影響到藥物間相互作用關(guān)系，故研究常見環(huán)境對砂仁揮發(fā)性成分的影響十分必要。本實驗采用自動頂空進樣-氣質(zhì)聯(lián)用分析通過施加溫度、光照、濕度因素[8]，模擬常見儲藏條件變化對砂仁細粉中揮發(fā)性成分的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

QE-300高速萬能粉碎機(浙江屹立工貿(mào)有限公司)；DHG-9140電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；7890B-5975C氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，7697A自動頂空進樣器(美國Agilent公司)。

1.2 試藥

砂仁購自陜西興盛德藥業(yè)有限責任公司，由陜西中醫(yī)藥大學胡本詳教授鑒定為陽春砂正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品處理

取適量干燥砂仁飲片至粉碎機中粉碎，過6號篩，-20 ℃避光放置備用。

2.2 HS-GC-MS條件

頂空進樣器參數(shù)：加熱箱90 ℃、定量環(huán)100 ℃、傳輸線110 ℃，平衡時間20 min，樣品持續(xù)時間1 min，GC循環(huán)時間50 min。

GC參數(shù)：HP-5M色譜柱，加熱器230 ℃，分流比為5∶1，程序升溫：初始溫度50 ℃，保留3 min；以6 ℃·min-1升至100 ℃，保留2 min；以6 ℃·min-1升至140 ℃，保留2 min；以4 ℃·min-1升至185 ℃，保留3 min；以30 ℃·min-1升至230 ℃，保留2 min。

質(zhì)譜參數(shù)：電離模式，電子轟擊離子源70 eV，離子源溫度280 ℃，掃描范圍m/z 35～500。

2.3 儲存條件

取砂仁細粉2.5 g，置于玻璃透明的扁平稱量瓶中，以加熱、光照(1000 lx±500 lx)、濕度(90%)為影響因素，按照表1條件進行48 h干預。

表1 干預條件

注：“—”表示不給予相應處理。

2.4 樣品檢測

精密稱取“2.3”項下的砂仁細粉0.5 g，置于20 mL頂空進樣瓶中，在“2.4”項條件下進行檢測。

2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)NIST14.0庫與相關(guān)文獻對檢出峰進行檢索，并通過面積歸一化法確定各組分峰相對含量，對相對含量在1%以上的揮發(fā)性成分用SPSS軟件進行主成分分析及匯總，采用Rstudio軟件將數(shù)據(jù)熱圖處理并進行聚類分析。

2.6 主成分分析

通過檢索NIST14.0數(shù)據(jù)庫，結(jié)合相關(guān)文獻，共鑒定了72個化合物，以烯烴類為主，其中乙酸龍腦酯、樟腦、d-檸檬烯、β-石竹烯、崁烯、β-蒎烯、月桂烯、冰片等成分含量皆不小于1%，通關(guān)對相關(guān)成分進行主成分分析，最終得到2個主成分，第一主成分乙酸龍腦酯對方差貢獻率為89.075%，第二類主成分樟腦方差貢獻為6.028%，兩者累計貢獻率達到95.102%。各干預條件下測得總離子流圖如圖1所示。

注：A～H為表1中的干預條件；I為-20 ℃的保存條件。圖1 各干預條件下測得總離子流圖

2.7 影響砂仁揮發(fā)性成分穩(wěn)定性因素

揮發(fā)油在儲存過程中會受到溫度、濕度、光照等因素影響而品質(zhì)改變。對相對含量較高的24種成分進行匯總，相對變化如表2、圖2所示。因低溫避光環(huán)境對揮發(fā)油成分影響較小，故以-20 ℃各成分相對含量作為參照，對其他8種干預條件進行熱圖分析，如圖2所示。其中化合物可聚為3類，分別為乙酸龍腦酯、樟腦和其他類，說明兩者為主要成分，與上述主成分分析結(jié)果一致。影響因素聚為2類，分別為40 ℃、90%濕度綜合影響與其他類。

注：W代表高濕；L代表光照；D代表避光；A代表干燥；“—”表示未檢測到。

注：A～H為表1中的干預條件；I為-20 ℃的保存條件。圖2 不同影響因素下?lián)]發(fā)性成分變化熱圖

升高溫度，對單萜烯烴、含氧類烯烴影響較大，如d-檸檬烯、β-石竹烯、冰片、芳樟醇、乙酸龍腦酯等化合物相對含量皆有所降低；當給予光照時，多烯類成分含量變化較為顯著，如白菖烯、α-律草烯、α-水芹烯、欖香烯等相對含量皆有不同程度降低；增加濕度，芳樟醇、α-水芹烯、樟腦含量降低，而反式-橙花叔醇、桉油烯醇、β-倍半水芹烯無明顯變化。

同時施加3種干預條件(光照、90%濕度、40 ℃)，能顯著降低砂仁中揮發(fā)性成分的含量，其效果強于單因素單獨作用，如乙酸龍腦酯、樟腦、檜烯、冰片、d-檸檬烯、芳樟醇含量分別降低了79.0%、78.2%、60.5%、87.5%、100%；單獨給予光照時，對多烯類成分有較大的影響，而在高溫高濕聯(lián)合干預下，光照對其含量變化無顯著性影響；高溫和光照聯(lián)合干預，能加速檸檬烯含量的降低，對樟腦等含氧烯萜化合物則起到延緩降低的作用；高濕對大多數(shù)化合物含量無顯著影響，但與溫度或光照聯(lián)合作用，能顯著降低大多數(shù)化合物相對含量。

2.8 主要成分受環(huán)境干預影響分析

以I(-20 ℃)因素下各化合物相對含量為基準，對各干預條件下4種主要成分含量變化進行分析，如圖3所示。圖中可以明顯看出，溫度、濕度、光照單獨或聯(lián)合作用，對d-檸檬烯、乙酸龍腦酯含量有不同程度的降低。乙酸龍腦酯在E(40 ℃、光照、90%適度)環(huán)境下含量降低最為顯著，d-檸檬烯在G(40 ℃、90%濕度、避光)、E(40 ℃、90%濕度、光照)環(huán)境下含量變化明顯，說明溫度、濕度聯(lián)合作用對d-檸檬烯含量影響大，此時，光照對其已無顯著性的影響。含氧烯樟腦在B、C環(huán)境下成正向變化，說明在室溫干燥環(huán)境下對含氧烯萜化合物起到延緩衰減的效果。β-石竹烯除在3種因素聯(lián)合作用下含量降低，其余環(huán)境下皆成正向變化，說明β-石竹烯在一般環(huán)境下較為穩(wěn)定。

注：縱向分布為表1中的干預條件；橫向為各化合物較對照組含量增減程度。圖3 4種主要成分在干預條件下的含量變化

3 討論

本實驗模擬砂仁在大多數(shù)處方中以原藥粉入藥的狀態(tài)，未對砂仁揮發(fā)油進行提取，而采用HS-GC-MS，在不破壞藥材油細胞的前提下，依靠升溫孵化，提取揮發(fā)性成分，分析砂仁細粉在溫度、濕度、光照單獨或綜合干預下對相關(guān)化合物含量的影響，盡可能還原砂仁揮發(fā)性成分在處方中的變化情況，為藥材的儲存、提取揮發(fā)油的前期研究及后期制劑設(shè)計提供依據(jù)。

實驗采用面積歸一化法測得各成分峰面積占總峰面積的量[9]，結(jié)果表明，砂仁中的揮發(fā)性成分以烯萜類為主，除大量共有成分外，8種干預條件測試下都能檢索到少量的新的成分，但因含量過小，故未給予比較分析。這些成分是因環(huán)境改變導致成分氧化或分解產(chǎn)生，還是由于外界攜帶產(chǎn)生，后期會加大樣品量，對新化合物的產(chǎn)生做進一步分析。

高溫、光照因素提供了足夠的反應條件及能量、高濕因素創(chuàng)造了充足的氧環(huán)境、3種因素聯(lián)合干預下，砂仁的品質(zhì)急劇惡化，應及時存放在低溫(0 ℃下)、干燥(濕度<40%)、避光的環(huán)境下以達到更好的使用效果。實驗結(jié)果表明，砂仁可短期放在室溫干燥的條件下，可能是由于揮發(fā)油在細胞內(nèi)，受各種膜及纖維的保護，削弱了外環(huán)境的干擾。利用這一特點，高波[10]等導入“藥輔合一”的思想，將含有揮發(fā)油的藥材直接粉碎，而未進行提取包合處理，相當于揮發(fā)油在細胞中受細胞壁保護，抑制了揮發(fā)，增強了穩(wěn)定性。張定堃等[11]在“藥輔合一”思想下，借鑒粒子設(shè)計技術(shù)，通過微觀層面的設(shè)計，成功制備了“殼—核”包覆結(jié)構(gòu)的改性口腔潰瘍散，將易揮散的冰片包裹在內(nèi)，提高了制劑品質(zhì)。粒子設(shè)計技術(shù)是指在具有亞微觀尺寸的粒子空間上對材料進行設(shè)計、研究、制造，以期亞微觀粒子本身及由它構(gòu)成的材料具有更好的性能、功能乃至智能，現(xiàn)廣泛應用于化工、醫(yī)療、建筑等行業(yè)。中藥粒子設(shè)計技術(shù)是通過調(diào)控入藥粉末粒徑，加入時間及加入順序等，使得藥物粉體間相互分散、包裹而形成特定的結(jié)構(gòu)與功能[12]，以改善制劑品質(zhì)。本實驗也是考查不同影響因素對砂仁揮發(fā)性成分影響，以期對后期課題借鑒粒子設(shè)計的手段對復方丸、散劑制備工藝進行調(diào)整，分析揮發(fā)性成分經(jīng)新工藝處理后的變化，為揮發(fā)性物質(zhì)在制劑中的保留率及穩(wěn)定性提供依據(jù)。