合生元對(duì)慢性功能性便秘患者腸道特定菌群的影響及其功能注釋

黃林生 ，屈瀟 ，孔程 ，潘登登 ，張曉輝 ，沈通一 ，秦環(huán)龍 *

隨著生活條件和飲食結(jié)構(gòu)的改變，慢性便秘的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，慢性功能性便秘（CFC）在各年齡段人群中均有發(fā)生，特別是在老年人群中發(fā)病率更高［1］。目前便秘的臨床治療有傳統(tǒng)藥物治療（膨松劑、瀉劑、糞便軟化劑、栓劑、促動(dòng)力藥、促腸液分泌劑）、灌腸、骨盆肌肉訓(xùn)練（生物反饋治療）和手術(shù)治療［2］，然而微生態(tài)治療目前已逐漸作為一種新的選擇，如益生菌［3］、益生元［4］、合生元［5］和糞菌移植（FMT）［6］等方法。

本課題組前期的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)CFC與腸道菌群紊亂存在關(guān)聯(lián)，采用合生元進(jìn)行治療不僅能夠起到較好的臨床效果，還能改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道微環(huán)境的改善［7］。目前乳酸桿菌和雙歧桿菌被認(rèn)為是傳統(tǒng)的益生菌，其豐度水平下降被認(rèn)為是疾病和老齡化的標(biāo)志［8］，而微生態(tài)制劑以這兩種益生菌為主要成分，因此本研究將進(jìn)一步檢測(cè)相關(guān)益生菌菌群的豐度水平，同時(shí)基于前期的研究結(jié)果進(jìn)一步行代謝相關(guān)的功能注釋，從而探討CFC的發(fā)病機(jī)制及微生態(tài)治療的可能機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年7月—2017年3月，選取本課題組前期納入的24例CFC患者［7］，根據(jù)送檢糞便樣本量及16S-rRNA結(jié)果剔除離群值，最終篩選出6例CFC患者。6例患者均采用合生元（商品名誼暢）進(jìn)行治療，每條制劑（長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌以及低聚木糖）包含1×1010CFU/g的益生菌。服用方法為飯后30 min溫水送服，3次/d，持續(xù)治療1個(gè)月。同時(shí)在社區(qū)招募6例健康者作為健康組。健康組無(wú)CFC及其他慢性疾病，納入前未服用益生菌和抗生素等藥物。本研究經(jīng)同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（SHSY-IEC-3.0/16-53/01）通過(guò)?；颊呔橥?。研究對(duì)象的基本信息見(jiàn)表1。

表1 研究對(duì)象的基本信息Table 1 Baseline data of the participants

1.2 菌群檢測(cè)及分析 便秘組患者于門(mén)診留取新鮮糞便樣本，給予合生元治療1個(gè)月后再次收集糞便樣本。同時(shí)在社區(qū)留取健康組的糞便樣本，與冰塊一起運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室并存放于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待檢測(cè)。（1）DNA抽提：依據(jù)糞便樣本類型使用相應(yīng)的試劑盒抽提DNA。（2）DNA質(zhì)檢：使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA并檢測(cè)DNA水平。（3）DNA片段化：將DNA打斷成約500 bp的片段。（4）文庫(kù)構(gòu)建：DNA片段末端修復(fù)和連接A堿基，在DNA片段兩端連接接頭，瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段篩選，PCR擴(kuò)增和純化，Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)大小，qPCR檢測(cè)文庫(kù)摩爾濃度，NaOH變性，產(chǎn)生單鏈片段。（5）Cluster簇生成：DNA片段的一段與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片flow cell上，另一端隨機(jī)與附近另一個(gè)引物互補(bǔ)，并進(jìn)行固定，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇，再線性化成為單鏈。（6）Illumina HiSeq測(cè)序，在flow cell加入DNA聚合酶和4種熒光標(biāo)記的Dntp，每次循環(huán)只摻入單種堿基，激光掃描芯片，捕捉熒光信號(hào)，讀取核苷酸種類。重復(fù)上述過(guò)程，依次統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板DNA片段序列。檢測(cè)并計(jì)算各菌群的豐度水平。

1.3 生物信息分析 （1）基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋統(tǒng)計(jì)：運(yùn)用KEGG圖形功能來(lái)表達(dá)各個(gè)代謝途徑及各途徑之間的關(guān)系，同時(shí)將不同的代謝途徑進(jìn)行分類并對(duì)存在聯(lián)系的相關(guān)代謝途徑進(jìn)行關(guān)聯(lián)。最后運(yùn)用BLAST將檢測(cè)出的基因集與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的KO注釋信息。（2）KO是蛋白質(zhì)（酶）的一個(gè)分類體系，將序列高度相似并且在同一條通路上有相似功能的蛋白質(zhì)歸為一組。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)得到的KO注釋信息，累加對(duì)應(yīng)的基因豐度，得到KO豐度水平。（3）KO的主成分分析（PCA）：將數(shù)據(jù)變換到一個(gè)新的坐標(biāo)系統(tǒng)中，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的降維保持?jǐn)?shù)據(jù)集對(duì)方差貢獻(xiàn)最大的特征。第一大方差在第一個(gè)坐標(biāo)（稱為第一主成分）上，第二大方差在第二個(gè)坐標(biāo)（第二主成分）上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用Fisher's確切概率法。菌群豐度水平治療前后的比較采用配對(duì)樣本的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本比較均采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 傳統(tǒng)益生菌的豐度水平比較 10種雙歧桿菌在種水平被檢出，其中健康組B.dentium豐度水平高于便秘組治療前，便秘組治療前B.adolescentis、B.animalis豐度水平高于健康組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。便秘組治療后B.animalis豐度水平較便秘組治療前增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

38種乳酸桿菌被檢出，其中健康組L.oris、L.reuteri豐度水平高于便秘組治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。便秘組治療后L.oris豐度水平較治療前增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表3）。

合生元中補(bǔ)充的益生菌（長(zhǎng)雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、乳雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌）豐度水平在治療前后變化不明顯，本研究未列出具體數(shù)據(jù)。

埃希菌屬共計(jì)8種菌群被檢出，其中Escherichia_coli（0.022與 0.001，Z=-2.201，P=0.028） 經(jīng) 過(guò) 合 生元治療后豐度降低。普氏菌屬（Prevotella）共計(jì)33種菌種被檢出，其中便秘組治療前P-denticola（0與1.85×10-6，Z=-2.286，P=0.028），P-melaninogenica（4.43×10-8與 1.09×10-6，Z=-2.137，P=0.040），P-multiformis（0 與 1.39×10-5，Z=-2.678，P=0.028），P_s_MSX73（1.6310-7與 1.34×10-5，Z=-2.419，P=0.015），P_s_oral_taxon_317（0與 2.12×10-7，Z=-2.286，P=0.028），P_s_oral_taxon_472（0 與3.16×10-7，Z=-2.286，P=0.028）6種菌群豐度水平健康組，而便秘組治療前Prevotella_s_C561菌（1.51×10-5與3.41×10-6，Z=-2.242，P=0.026）豐度水平高于便秘組治療后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 健康組和便秘組治療前雙歧桿菌和乳桿菌豐度水平比較Table 2 Comparison of the abundance of Bifidobacterium and Lactobacilli between the healthy group and constipation group before treatment

表3 便秘組治療前、后雙歧桿菌的豐度水平比較Table 3 Comparison of the Bifidobacterium and Lactobacillus abundance in constipation group before and after treatment

2.2 基因功能注釋 對(duì)健康組、便秘組治療前、便秘組治療后的所有菌群數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG功能預(yù)測(cè)注釋，腸道菌群基因和碳水化合物、氨基酸的代謝十分相關(guān)，基因所占比例超過(guò)10%（見(jiàn)圖1）。根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)得到的KO注釋信息，累加對(duì)應(yīng)的基因豐度，選取所用樣品中豐度排名前30的KO及其在每個(gè)樣品中的豐度信息繪制熱圖。通過(guò)對(duì)3組樣本的KO集進(jìn)行熱圖分析對(duì)比發(fā)現(xiàn)KO2014在便秘組治療前、后含量均較高，即葡萄糖dTDP-4、6-脫水酶在便秘組治療前后的豐度水平較高（見(jiàn)圖2）。而通過(guò)對(duì)3份樣本的KO集進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)便秘組治療前、后與健康組菌群KO集差異明顯，而便秘組治療前、后差異不明顯。其PCA1值為27.47%，PCA2值為12.01%（見(jiàn)圖3）。

圖1 KEGG注釋結(jié)果分類統(tǒng)計(jì)Figure 1 Classification statistical results of KEGG annotation

3 討論

最近慢性便秘的微生態(tài)治療受到越來(lái)越多的關(guān)注，但目前國(guó)內(nèi)外研究關(guān)注較多的是微生態(tài)治療的臨床效果，缺乏對(duì)微生態(tài)治療對(duì)腸道微環(huán)境影響的進(jìn)一步分析［9-10］。雙歧桿菌和乳酸桿菌一直被認(rèn)為是傳統(tǒng)的益生菌，部分已知的種類一直被廣泛應(yīng)用于益生菌產(chǎn)品中，L.reuteri DSM 17938在預(yù)防嬰幼兒便秘、增加排便次數(shù)和降低便秘帶來(lái)的醫(yī)療費(fèi)用增加方面具有積極的作用［11］，另一綜述證明L.reuteri在兒童中應(yīng)用是安全和有效的［12］。但益生菌應(yīng)用于CFC的科學(xué)性還有待進(jìn)一步研究。

在前期研究基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序和分析，對(duì)便秘組治療、前后的腸道菌群行進(jìn)一步鑒定。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌中健康組B.dentium豐度水平高于便秘組治療前，而便秘組治療前B.adolescentis和B.animalis豐度水平高于健康組，便秘組治療后B.animalis豐度水平較治療前增加。乳酸桿菌中健康組L.oris和L.reuteri豐度水平高于便秘組治療前。Prevotella菌中6種菌屬健康組豐度水平高于便秘組治療前。國(guó)外相關(guān)試驗(yàn)也有不同的發(fā)現(xiàn)，KIM等［13］發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium和Bacteroides菌群豐度水平在CFC患者的糞便中是降低的，而B(niǎo).longum在便秘兒童中的豐度水平較高［14］。ZHU等［15］發(fā)現(xiàn)Prevotella菌屬在便秘人群中的豐度水平是降低的，本研究結(jié)果與之相似。

圖2 健康組、便秘組治療前、便秘組治療后KO集熱圖比較Figure 2 Heatmap of KO in the samples of healthy group，constipation group before treatment，constipation group after treatment

圖3 健康組、便秘組治療前、便秘組治療后KO的主成分分析結(jié)果Figure 3 PCoA of KO in the samples of healthy group，constipation group before treatment，constipation group after treatment

在研究慢性便秘人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)及采用微生態(tài)制劑進(jìn)行治療時(shí)需考慮到年齡因素對(duì)結(jié)果的干擾。B.longum、B.breve和B.bifidum在嬰幼兒中處于優(yōu)勢(shì)菌群，而B(niǎo).catenulatum、B.adolescentis和B.longum在成年人群中處于優(yōu)勢(shì)地位［8］。另一項(xiàng)綜述研究發(fā)現(xiàn)B.lactis，而非L.casei作為益生菌治療時(shí)能夠顯著降低腸道傳輸時(shí)間，恢復(fù)糞便的性狀和增加排便次數(shù)［3］。一項(xiàng)meta分析發(fā)現(xiàn)益生菌治療能夠增加排便次數(shù)，分組研究顯示在亞洲人群的治療中只能增加排便次數(shù)，但對(duì)糞便的性狀沒(méi)有明顯改善［16］。因此并不是所有的傳統(tǒng)益生菌均適用于對(duì)慢性便秘的治療，通過(guò)對(duì)特定年齡的腸道菌群分析，并基于嚴(yán)格的菌群結(jié)構(gòu)特定進(jìn)行針對(duì)性的治療甚至是進(jìn)行個(gè)性化的治療才是未來(lái)微生態(tài)研究的重點(diǎn)方向。

本研究通過(guò)對(duì)腸道菌群功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)腸道菌群與腸道中的碳水化合物、氨基酸等物質(zhì)的代謝相關(guān)，但未能發(fā)現(xiàn)在CFC治療中發(fā)揮重要作用的相關(guān)基因，而代謝組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)腸道功能的改善不僅體現(xiàn)在對(duì)菌群的優(yōu)化［17］，還在于對(duì)乳酸、短鏈脂肪酸［18］和5羥色胺（5-HT）［19-20］等腸道代謝物的改變。

目前相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示菌群產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸（十七烷酸和硬脂酸）可促進(jìn)大鼠結(jié)腸肌肉收縮、增加排便頻率，而且與普氏菌屬、乳桿菌屬和別樣桿菌的豐度水平增高相關(guān)［21］，而腸道中色氨酸通過(guò)腸嗜鉻細(xì)胞色氨酸羥化酶1（TpH1）代謝產(chǎn)生5-HT，從而發(fā)揮刺激腸道運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)腸-腦軸信號(hào)等功能［22］，單胺與5-HT類似，通過(guò)對(duì)小鼠定殖可產(chǎn)生色胺的工程多形擬桿菌，可促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，這些研究為CFC的治療提供了更好的思路［23］。目前使用合生元治療CFC患者具有較好的臨床效果［24］，而基于腸道菌群研究的基礎(chǔ)上［25］，通過(guò)對(duì)菌群和代謝物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析，才能在未來(lái)的治療中提供精準(zhǔn)化的治療方案。

本研究在細(xì)菌種水平的角度揭示傳統(tǒng)益生菌在CFC以及在合生元治療中的改變情況，對(duì)菌群的定位更加精確，發(fā)現(xiàn)了不同益生菌在合生元治療中可能存在的意義，為實(shí)現(xiàn)CFC的精準(zhǔn)化治療提供依據(jù)。但本研究的不足之處在于樣本量還需進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)還需從糞便代謝組學(xué)方向?qū)εR床樣本進(jìn)行后續(xù)的驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：黃林生進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，撰寫(xiě)論文并對(duì)論文進(jìn)行修訂；沈通一進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；孔程進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；潘登登進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；張曉輝進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；屈瀟進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；沈通一、秦環(huán)龍負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；秦環(huán)龍對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。