GPRC5A抑制肺癌細(xì)胞A549增殖和遷移及與EGFR的相關(guān)性研究

黃華奇 聞劍波 江明君 石世青 趙子恩 黃科峰 葛建軍 戚賽春

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。僅在2013年，全國(guó)肺癌新發(fā)病例約73.28萬例，死亡病例約58.07萬例[1]。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，5年生存率低于15%[2-3]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）約占所有肺癌的80%。G蛋白偶聯(lián)受體 C 家族 5A（G protein-coupled receptor，GPRC5A）是一種由全反式維甲酸誘導(dǎo)的基因，也稱為維甲酸誘導(dǎo)蛋白 3（retinoic acid-induced 3，RAI3）。Tao 等[4]敲除小鼠GPRC5A基因?qū)е路伟┌l(fā)生，同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)，肺癌組織的GPRC5A的表達(dá)水平相較于鄰近的癌旁組織低。肺癌分子靶向藥物中，最受矚目的是表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）。Siegelin 等[5]發(fā)現(xiàn)，EGFR在超過60%的轉(zhuǎn)移性NSCLC中高表達(dá)，且與不良預(yù)后相關(guān)。本研究探討GPRC5A基因?qū)θ朔伟┘?xì)胞A549增殖和遷移能力的影響及其與EGFR的相關(guān)性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要細(xì)胞、試劑和培養(yǎng)液 A549細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究所；真核表達(dá)載體pLenti6.3-MCS購(gòu)自上海諾百生物科技有限公司；DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、吐溫-20及新生FBS購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染 試 劑 、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase、SYBR GreenⅠ購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；OBIO cell count kit（CCK-8）購(gòu)自和元生物技術(shù)（上海）股份有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 (增強(qiáng)型)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tanswell plate購(gòu)自美國(guó)Corning Costar公司；單克隆抗體GPRC5A、EGFR購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心檢索，查出人GPRC5A的mRNA序列（NM_003979.3），設(shè)計(jì)特異性引物（酶切位點(diǎn)（Nhe I/Asc I）；擴(kuò)增引物 F：5′-GCTAGC ATGGC TACAA CAGTC CCTGA TGG-3 ′；R：5 ′-GGCGCGCC TTAGE TGCCC TCTTT CTTTA CTTCA TAGT-3′） 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，重組到載體pLenti6.3-MCS中，并測(cè)序驗(yàn)證。PCR 擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)熱 2min，94℃變性30s，60 ℃退火40s，72℃延伸1min，變性至延伸共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸10min。用NheⅠ、AscⅠ內(nèi)切酶分別雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pLenti6.3-MCS，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收目的片段，在T4 DNA連接酶作用下，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選Amp抗性的完全落單的菌落，PCR鑒定測(cè)序，命名為pLenti6.3-MCS-GPRC5A。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和陽性克隆篩選 選擇狀態(tài)良好的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種至24孔板中。37℃培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞融合至70%密度。實(shí)驗(yàn)開始前，更換無血清Opti-MEM培養(yǎng)基。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將pLenti6.3-MCS-GPRC5A、pLenti6.3-MCS質(zhì)粒與Lipofectamine 2000按照合適比例轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4～6h后，更換DMEM完全培養(yǎng)基。48h后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞按1∶4傳代，繼續(xù)培養(yǎng)24h，換含新霉素400μg/ml的培養(yǎng)液篩選2周。挑取單細(xì)胞陽性克隆繼續(xù)在含新霉素200μg/ml的培養(yǎng)液中擴(kuò)大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pLenti6.3-MCS-GPRC5A質(zhì)粒的細(xì)胞命名為A549-GPRC5A，轉(zhuǎn)染pLenti6.3-MCS質(zhì)粒的細(xì)胞命名為A549-NC。

1.4 GPRC5A和EGFR mRNA檢測(cè)表達(dá)情況 采用實(shí)時(shí)熒光定量-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)靶基因的表達(dá)。先利用TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SYBR GreenⅠ說明書要求配制反應(yīng)體系，采用美國(guó)Bio-Rad熒光定量PCR儀（CFX96TMReal-Time Systerm）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以 β 肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法比較A549-GPRC5A和A549-NC細(xì)胞中GPRC5A和EGFR mRNA的表達(dá)水平。GPRC5A引物為 F∶5′-GCTGC TCACA AAGCA ACGAA-3′，R∶5′-ATAGAGCGTGTCCCCTGTCT-3 ′；EGFR 引 物 為 F∶5 ′-CAGAT GGATG TGAAC CCCGA，R∶5′-TTCTT ACACT TGCGG ACGCC。

1.5 GPRC5A和EGFR蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用Western blot方法檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)。收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。樣品加入5×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸5min，取20μg蛋白上樣。聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結(jié)束。取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜。取下膜，先用含有吐溫-20的PBS溶液（PBST）洗滌4次，每次5min。將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃1h。用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中4℃過夜。次日將膜取出后用PBST洗膜4次，每次5min，用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應(yīng)1h。反應(yīng)完畢后，將膜取出置于干凈的盒子中洗膜4次，每次5min。電化學(xué)發(fā)光法顯影、曝光。利用Image J軟件分析WB條帶的灰度值。

1.6 A549細(xì)胞增殖情況檢測(cè) 采用CCK-8法，取兩組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)5個(gè)平行孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于 24、48、72h 后，在每孔中加 10μl的 CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2h后，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，取5個(gè)孔的平均值，比較兩組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)增殖速度的變化和GPRC5A對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制效果。

1.7 A549細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用Transwell方法，首先把含8μm孔徑PET膜的Transwell小室放置在無血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃平衡30min，準(zhǔn)備待用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，分別用無血清的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為1E5/ml。Transwell培養(yǎng)板下室加入800μl含血清的完全培養(yǎng)基，上室加入200μl細(xì)胞懸液。于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出Transwell小室，用棉簽擦去膜靠近內(nèi)室上層的細(xì)胞，下層細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30min，1%結(jié)晶紫染色10min，用清水洗3遍以上。顯微鏡下觀察，利用ipwin32軟件計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 3、4泳道顯示的兩條帶大小分別為8.9kb和1kb，與pLenti6.3-MCS-GPRC5A的大小一致（圖1）。pLenti6.3-MCS-GPRC5A陽性重組克隆子的測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)的GPRC5A基因mRNA序列完全相同，說明pLenti6.3-MCS-GPRC5A真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 pLenti6.3-MCS-GPRC5A質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果（1：DL10000 DNA Marker；2：環(huán)狀 pLenti6.3-MCS-GPRC5A 質(zhì)粒；3：pLenti6.3-MCS質(zhì)粒；4：GPRC5A片段）

2.2 兩組細(xì)胞GPRC5A、EGFR mRNA和蛋白表達(dá)情況的比較見表1。

表1 兩組細(xì)胞GPRC5A、EGFR mRNA和蛋白表達(dá)情況的比較

由表1可見，與A549-NC細(xì)胞比較，A549-GPRC5A細(xì)胞GPRC5A mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯上升，EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低。Western blot檢測(cè)靶蛋白的電泳圖見圖2。

圖2 兩組細(xì)胞GPRC5A和EGFR蛋白表達(dá)的電泳圖

由圖2可見，與A549-NC細(xì)胞比較，A549-GPRC5A細(xì)胞GPRC5A電泳條帶明顯變粗，EGFR電泳條帶顯著變細(xì)。

2.3 兩組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)的增殖情況見表2。

表2 兩組細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)增殖情況（OD值）

由表2可見，與A549-NC細(xì)胞比較，A549-GPRC5A細(xì)胞同一時(shí)間段內(nèi)的OD值均較低，其中24、48和72h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GPRC5A細(xì)胞對(duì)A549細(xì)胞增殖抑制率在24、48、72h分別為22.34%、31.28%、33.52%。

2.4 兩組細(xì)胞遷移能力比較 A549-GPRC5A細(xì)胞和A549-NC細(xì)胞遷移的數(shù)目分別為（453.0±21.20）個(gè)和（751.0±18.36）個(gè)。與A549-NC細(xì)胞相比，A549-GPRC-5A細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少，表明GPRC5A對(duì)A549細(xì)胞的遷移有抑制作用。兩組細(xì)胞遷移情況見圖3。

圖 3 兩組細(xì)胞遷移情況（a：A549-GPRC5A；b：A549-NC；結(jié)晶紫染色法，×100）

3 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)NSCLC分子機(jī)制的大量研究發(fā)現(xiàn)，肺癌發(fā)生過程中存在許多起關(guān)鍵性作用的遺傳突變——驅(qū)動(dòng)型突變[6]，肺癌的發(fā)生或維持離不開這些突變。其中，EGFR發(fā)生了最明顯的激活突變。磷酸化的EGFR激活下游 RAS/RAF/MEK/MAPK，PI3K/AKT和JAK/STAT等信號(hào)通路[7]。這些通路對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、轉(zhuǎn)移侵襲、抑制促凋亡蛋白等功能發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)階段，NSCLC中EGFR靶向治療藥物的研發(fā)仍是熱點(diǎn)。

G蛋白偶聯(lián)受體是人體內(nèi)最大藥物靶標(biāo)蛋白質(zhì)超家族，目前已報(bào)道了約2000種不同的GPCRs[8]。GPRC5A是GPCRs C型家族中的一員，定位于染色體12p12.3-p13區(qū)域，它包含的7個(gè)α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域是抑制EGFR活性所必須的。自1998年GPRC5A基因在人頭頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株UMSCC-22B中被發(fā)現(xiàn)后，眾多學(xué)者對(duì)其功能進(jìn)行探究。GPRC5A被發(fā)現(xiàn)主要在肺組織表達(dá)[4,9-10]，在其他組織中低表達(dá)或者不表達(dá)，表明其在肺組織中有著特殊的作用。在肺腫瘤細(xì)胞或組織中，GPRC5A表達(dá)被抑制或者敲除后，EGFR、STAT3、NF-κB、cAMP等多個(gè)信號(hào)通路被過度激活[11-14]，對(duì)肺腫瘤發(fā)生起著非常重要的作用。GPRC5A在調(diào)控cAMP的過程中存在一個(gè)負(fù)反饋的環(huán)路，過表達(dá)GPRC5A被發(fā)現(xiàn)能夠降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平[14]。cAMP通路的活化在許多腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，能夠促進(jìn)酪氨酸磷酸化，顯著地反式激活EGFR[15]。體內(nèi)激活的EGFR通過催化GPRC5A羧基端酪氨酸殘基Y317/320和Y347/350發(fā)生磷酸化，與GPRC5A基因進(jìn)行互作[16]。鐘霜霜等[17]表明，STAT3是EGFR下游的信號(hào)通路，GPRC5A-/-（敲除型）小鼠氣管上皮細(xì)胞和肺組織中EGFR-STAT3信號(hào)通路發(fā)生過度激活，且在人肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)GPRC5A能夠抑制EGFR信號(hào)通路的激活。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)GPRC5A-/-小鼠肺上皮細(xì)胞中STAT3的磷酸化水平較高且持續(xù)性激活，其調(diào)控的BCL-XL、Cryab等抗凋亡基因的表達(dá)水平都較高。在肺癌、肝癌等多種腫瘤中，磷酸化的EGFR可以通過IKK激酶復(fù)合物激活NF-κB，進(jìn)而給癌細(xì)胞傳遞致癌信號(hào)[18]。Deng等[13]研究發(fā)現(xiàn)，GPRC5A-/-小鼠的肺上皮細(xì)胞中NF-κB的活性加強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞自主性增高，炎性反應(yīng)增強(qiáng)，最終協(xié)同產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生的微環(huán)境。上述研究表明，GPRC5A與肺癌細(xì)胞多個(gè)通路存在關(guān)聯(lián)，其發(fā)揮功能最主要的途徑是抑制EGFR通路的激活。

現(xiàn)今有關(guān)GPRC5A與EGFR相關(guān)性的報(bào)道較少，GPRC5A對(duì)肺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能需要進(jìn)一步研究。GPRC5A與EGFR通路的關(guān)聯(lián)需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步挖掘，GPRC5A能否通過其他未研究的通路對(duì)肺癌細(xì)胞造成影響也需要探究發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)的目的是了解GPRC5A對(duì)肺癌細(xì)胞A549的影響并且探討其與EGFR通路的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GPRC5A后，A549細(xì)胞中EGFR mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖受到明顯抑制，遷移能力減弱，表明GPRC5A可能通過抑制EGFR通路的激活對(duì)細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。這些研究為更好地了解GPRC5A在肺癌細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為深入探討GPRC5A和EGFR的相互作用奠定了一定基礎(chǔ)。