納米槲皮素對(duì)MCF－7和MCF/ADR細(xì)胞耐藥性影響研究

駱 濱，胡旭虎，王 強(qiáng)

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢430074)

1 引言

槲皮素是一種具有代表性的生物活性黃酮醇。促細(xì)胞分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1～12]。不但能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)多種藥物的耐藥性，并且與多柔比星、順鉑等抗腫瘤藥物聯(lián)合使用可有效提升抗腫瘤效果[1]。但由于槲皮素分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)，決定了其不太適合于直接作為藥品使用，近年來(lái)槲皮素的結(jié)構(gòu)修飾和劑型改造工藝的增多，為其提供了非常好的研究機(jī)會(huì)[13～16]。槲皮素納米粒，槲皮素脂質(zhì)體，槲皮素固體脂質(zhì)納米粒，槲皮素膠束等是最常見的劑型[17～23]。納米槲皮素晶體也可稱為納米槲皮素懸浮液。它是通過將納米級(jí)的槲皮素微粒均勻分散在水溶液中以形成穩(wěn)定的亞微米膠體分散體系。形成的納米藥物結(jié)晶粒徑非常小，一般在10～1000 nm，當(dāng)藥物粒徑降至微米甚至降至納米級(jí)別時(shí)，其飽和溶解度會(huì)得到顯著提升。然而，通常需要在溶液中加入聚合物或表面活性劑以穩(wěn)定體系[24]。隨著飽和溶解度的增加，藥物的溶出速率也增加。因此納米結(jié)晶不僅可以提高藥物的溶出率，而且可以提高藥物的飽和溶解度，從而提高像槲皮素等難溶性藥物的口服利用度[25]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 樣品、試劑和儀器

槲皮素原料藥(純度99.0%，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司)和對(duì)照品(中國(guó)國(guó)家藥品生物制品檢定所)，胰蛋白酶(Gibco，USA)，1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)，胎牛血清(Gibco，USA)，CCK－8試劑(上海Beyotime)，鹽酸多柔比星(Aladdin)，MCF－7細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù))，MCF/ADR細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù))，Tween－20(gibco，USA)，Glycine(gibco，USA)，P－糖蛋白抗體(Abcom，UK)，β－action抗體(Abcom，UK)，山羊抗兔二抗(Abcom，UK)，RIPA裂解液(上海Beyotime)，脫脂奶粉(上海Yuanmu)，30%丙烯酰胺(PAEG，gibco，USA)，Tris－HCl緩沖液(p H6.8和p H8.8，gibco，USA)，十二烷基硫酸鈉(SDS，gibco，USA)，BCA蛋白試劑盒(上海Beyotime)，小分子蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Mark(Applygen公司)，上樣緩沖液(loading buffer，普利萊公司)；TEMED(gibco，USA)，Tris base(gibco，USA)，其他試劑均為分析級(jí)，實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水。ETSD4定時(shí)恒溫磁力攪拌器(IKA，German)，梅特勒－托利多PL203電子天平(Switzland)，UV－1800型紫外分光光度汁(SHIMADZU，Japan)，Millipore Direct8超純水儀(MERCK MILLIPORE，German)，Thermo fisher Nicolet iS10傅立葉紅外光譜儀(thermo，USA)，馬爾文Zetasizer Nano S90納米粒度分析儀(MalvernPanalytical)，Vortex－Genie2渦旋振蕩器(Scientific Industries，USA)，梅特勒－托利多FE20型p H計(jì)(Switzland)，超聲波清洗機(jī)(GuangDong GT Ultrasonic Inoustrialco＇ltd)，ThermoSavant ISS110 P1型離 心 濃縮儀(thermo，USA)，Thermo MICROCL21 R型冷凍離心機(jī)(thermo，USA)，Thermo311型細(xì)胞培養(yǎng)箱(USA)，吉爾森P型移液器系列(USA)，CHRIST ALPHA_1－4 LD型冷凍干燥機(jī)(German)，細(xì)胞計(jì)數(shù)器(南京漢龍實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀(USA)，奧林巴斯CKX41－A32 FL/PH型熒光倒置顯微鏡(Japan)。

2.2 制備納米槲皮素

用電子天平精密稱取0.5 g槲皮素粉末置于棕色稱量瓶中，加入一定量NaOH溶液，密封避光攪拌放置24 h。然后緩慢加入0.12 mol/L HCl溶液，調(diào)節(jié)溶液至p H值7～7.5，停止滴定。將經(jīng)p H值調(diào)節(jié)的槲皮素溶液濃縮至20 m L，得到濃度為25 mg/m L的槲皮素溶液。

2.3 納米槲皮素粒度測(cè)量

將適量的納米槲皮素溶液稀釋至合適的倍數(shù)，并通過納米粒度分析儀測(cè)量納米槲皮素粒度分布和Zeta電位。

2.4 紫外光譜比較納米槲皮素與乙醇及DMSO溶解的差異

稱取適量的槲皮素粉末，用DMSO，水和無(wú)水乙醇溶解并稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。使用相應(yīng)的溶劑作為空白，并在200～800 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行UV掃描，并記錄和比較紫外數(shù)據(jù)。

2.5 納米槲皮素對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性

取濃度為25 mg/m L的納米槲皮素溶液，用配好的胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液將其稀釋成以下濃度梯度的溶液：0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mg/m L。將稀釋好的每組納米槲皮素溶液加入樣品細(xì)胞孔板中并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)以100μg/m L的濃度制備槲皮素DMSO溶液。再用上述細(xì)胞培養(yǎng)液按以下濃度梯度配置新的槲皮素溶液：0、1.25、2.5、5、10、25、50、100μg/m L。將每組濃度梯度的槲皮素溶液加入上述的樣品細(xì)胞孔板中并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 納米槲皮素對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響

分別用含納米槲皮素和普通的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋鹽酸多柔比星成相對(duì)應(yīng)濃度梯度，加入各處理好的細(xì)胞孔中培養(yǎng)，然后從各個(gè)濃度組中取出3個(gè)平行孔。1 h后檢測(cè)各孔的OD450值并記錄，計(jì)算各組細(xì)胞的細(xì)胞活度值并繪制活度關(guān)系曲線。

2.7 納米槲皮素對(duì)細(xì)胞吸收多柔比星的影響

用含有納米槲皮素的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋含有50μg/m L，100μg/m L的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基。將MCF－7細(xì)胞和MCF/ADR細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞到六孔板(200000細(xì)胞/孔)中。在后續(xù)培養(yǎng)中取四個(gè)孔接種細(xì)胞并用含50μg/m L及100μg/m L的納米槲皮素培養(yǎng)液分別培養(yǎng)48 h和72 h。取兩個(gè)孔并在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后用PBS緩沖液清洗。以上各組各取一孔加入含多柔比星0.5μg/m L的細(xì)胞培養(yǎng)液，將另一組添加到正常培養(yǎng)對(duì)照中。后續(xù)培養(yǎng)后加入正常培養(yǎng)基，用488 nm波長(zhǎng)熒光激發(fā)觀察各孔中細(xì)胞內(nèi)多柔比星的分布及強(qiáng)度然后拍照記錄。計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中多柔比星的熒光強(qiáng)度值并繪圖。

3 結(jié)果與討論

3.1 納米槲皮素結(jié)構(gòu)表征

如圖1所示，納米級(jí)槲皮素的粒徑大小幾乎都在124 nm附近。制備納米槲皮素粒度分布在100～200 nm之間，顆粒相對(duì)均勻。如表1所示，混懸液的Zeta電位為－32.9 m V，形成了一種相對(duì)穩(wěn)定的懸浮系統(tǒng)。

圖1 納米級(jí)槲皮素粒度分布

表1 納米級(jí)槲皮素Zeta電位值

3.2 紫外光譜比較納米槲皮素與乙醇及DMSO溶解的差異

DMSO溶解的槲皮素溶液UV對(duì)照結(jié)果如圖2(a)所示，水稀釋溶液結(jié)果如圖2(b)所示，無(wú)水乙醇溶解溶液結(jié)果如圖2(c)所示，槲皮素在250 nm和375 nm波長(zhǎng)附近具有明顯吸收峰，并且UV吸收光譜非常相似。這表明以此方法制備的納米槲皮素在溶液中的分子結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，并未發(fā)生變化。

圖2 DMSO(a)、納米槲皮素水溶液(b)及乙醇溶解槲皮素(c)紫外吸收?qǐng)D譜

3.3 納米槲皮素對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

納米槲皮素對(duì)MCF－7細(xì)胞(A)和MCF/ADR細(xì)胞(B)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在圖3中。以DMSO溶解的槲皮素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)如圖4所示，結(jié)果表明制備的納米槲皮素具有較低的細(xì)胞毒性，對(duì)MCF－7細(xì)胞的IC50值約為2 mg/m L，對(duì)MCF/ADR細(xì)胞的IC50值約為1.5 mg/m L，已知溶液中的DMSO量越多，對(duì)細(xì)胞的危害越大，若對(duì)DMSO溶液的量進(jìn)行控制，槲皮素濃度便達(dá)不到要求，用含有0.5%DMSO的水溶液顯然不能制備200μg/m L濃度的槲皮素溶液。而以納米制劑形式存在的槲皮素則顯著提高了溶解性，溶解濃度可達(dá)到4 mg/m L。

圖3 納米槲皮素對(duì)MCF－7細(xì)胞(A)及MCF/ADR細(xì)胞(B)的細(xì)胞毒性

圖4 DMSO溶解槲皮素在MCF－7細(xì)胞(A)及MCF/ADR細(xì)胞(B)中的細(xì)胞毒性

3.4 納米槲皮素對(duì)細(xì)胞耐藥性影響實(shí)驗(yàn)

繪制的活動(dòng)曲線如圖所示。從圖5可知，以多柔比星處理MCF－7細(xì)胞時(shí)，得到IC50值為1.75μg/m L而用50μg/m L槲皮素溶液處理后的MCF－7細(xì)胞的IC50值上升為3μg/m L，這表明槲皮素可顯著提高M(jìn)CF－7細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性，圖6也這表明用槲皮素處理的MCF/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星具有增強(qiáng)的抗性。這表明高濃度的槲皮素具有增加腫瘤細(xì)胞抗性的潛力。

圖5 納米槲皮素對(duì)MCF－7細(xì)胞耐藥性的影響

圖6 納米槲皮素對(duì)MCF/ADR細(xì)胞耐藥性的影響

3.5 納米槲皮素對(duì)細(xì)胞吸收多柔比星的影響

圖7和表2總結(jié)了每組多柔比星中觀察到的MCF－7細(xì)胞的分布和熒光強(qiáng)度圖。圖8和表3總結(jié)了各組多柔比星中MCF/ADR細(xì)胞的分布和熒光強(qiáng)度圖。從結(jié)果可以看出，細(xì)胞可吸收多柔比星，并且細(xì)胞核的熒光反應(yīng)更強(qiáng)。槲皮素處理細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯弱于未處理組。并且結(jié)果表明高濃度的槲皮素可以以濃度和時(shí)間依賴性方式降低細(xì)胞內(nèi)多柔比星的濃度。從圖中還可以看出，高濃度的槲皮素處理后，2種腫瘤細(xì)胞的耐藥性明顯提升。通過計(jì)算每個(gè)細(xì)胞內(nèi)多柔比星的熒光強(qiáng)度值可看出，細(xì)胞內(nèi)熒光值與多柔比星的量成正比，熒光值越大，細(xì)胞毒性表現(xiàn)越明顯。

圖7 多柔比星及細(xì)胞流式儀檢測(cè)多柔比星在各組MCF－7細(xì)胞內(nèi)的分布及熒光強(qiáng)度

圖8 多柔比星及細(xì)胞流式儀檢測(cè)多柔比星在各組MCF/ADR細(xì)胞內(nèi)的分布及熒光強(qiáng)度

表2 多柔比星在MCF－7細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度

表3 阿霉素在MCF/ADR細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度

4 結(jié)論

(1)通過考察槲皮素的結(jié)構(gòu)特征，確定了納米槲皮素最優(yōu)的制備方法，制得的納米槲皮素粒徑小、溶解性提高。并紅外光譜和紫外光譜證實(shí)該制備方法不會(huì)改變槲皮素分子結(jié)構(gòu)。

(2)通過比較納米槲皮素與DMSO溶解的槲皮素兩種腫瘤細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，已證實(shí)納米槲皮素對(duì)MCF－7和MCF/ADR細(xì)胞具有較低的細(xì)胞毒性作用，其IC50值大于1.5 mg/m L。與DMSO溶解法相比具有更好的溶解性。并且經(jīng)過納米槲皮素處理的MCF－7和MCF/ADR細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐受性明顯提高。

(3)利用現(xiàn)有熒光分析方法和手段[26]，可得知用高濃度槲皮素處理后的MCF－7細(xì)胞和MCF/ADR細(xì)胞內(nèi)的多柔比星熒光強(qiáng)度明顯減弱，這表明細(xì)胞內(nèi)多柔比星的含量顯著下降。