棉花內(nèi)生芽孢桿菌LH-L3定殖能力研究

陳麗華，何鵬飛，歐曉慧，袁德超，吳毅歆,，何月秋,*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南昆明650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201；3.微生物菌種篩選與應(yīng)用國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南昆明650217)

植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物的組織或細(xì)胞內(nèi)，它們與寄主植物建立和諧共存的關(guān)系，具有促生、固氮、抗病蟲害、殺線蟲等多種作用[1-4]，目前已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。生防菌株能在根際土壤或植株體內(nèi)成功定殖是所有抑菌機(jī)制的基礎(chǔ)，內(nèi)生細(xì)菌的定殖是其與寄主植物互作發(fā)揮其自身作用的關(guān)鍵步驟。隨著生物技術(shù)和顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，植物內(nèi)生菌或病原菌在植物體內(nèi)侵染、定殖的檢測越來越容易[5]。目前檢測菌株定殖情況的方法有很多，其中綠色熒光蛋白標(biāo)記目標(biāo)菌株越來越普遍[6]。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)LH-L3(下稱LH-L3)是本實(shí)驗(yàn)室從健康棉株葉片中分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌，平板對峙試驗(yàn)表明其對多種病原菌有抑制作用，并對棉花黃萎病有很好的防病作用，且具有促生長效果[7]。研究生防菌 LH-L3在棉花上的定殖情況，有助于進(jìn)一步了解該菌株的防病促生機(jī)制。為了測定LH-L3的定殖能力，本文通過自然轉(zhuǎn)化法獲得了 GFP 標(biāo)記菌株，并對其定殖情況進(jìn)行跟蹤檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：LH-L3(CGMCC No.12565)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、玉米大斑病菌(Exserohiumturcicum)為本實(shí)驗(yàn)室分離保存，棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李志芳博士惠贈。

質(zhì)粒和抗生素：pHT01-P43GFPmut3a由本實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建，攜帶GFP基因和氯霉素(Cm)抗性基因，氯霉素使用終濃度為10 μg/mL。

作物：玉米(云禾單2號)為實(shí)驗(yàn)室自選種；甘藍(lán)(中甘21)、小麥(昆麥5號)和蠶豆(鳳豆6號)購于市場；棉種(冀棉11)由李志芳博士惠贈。

培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基，菌株LH-L3的自然轉(zhuǎn)化采用GCHE和GC培養(yǎng)基[7]。

1.2 LH-L3的自然轉(zhuǎn)化

參照何鵬飛[8]提供的方法。挑取新鮮劃線的LH-L3單菌落于液體LB中，37 ℃ 160 r/min振搖過夜培養(yǎng)；次日吸取LH-L3培養(yǎng)物于液體GCHE培養(yǎng)基中，使其光密度值OD600在0.3左右；37 ℃ 160 r/min振搖培養(yǎng)3～3.5 h，待其OD600達(dá)到1.4左右，加入等體積的GC培養(yǎng)液，稀釋混勻，37 ℃ 160 r/min繼續(xù)培養(yǎng)1.5～2 h；將此時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)物均勻分成兩份，5 000 g室溫離心6 min；吸取上清液200 μL懸浮菌體沉淀后，加入2 mL轉(zhuǎn)化緩沖液及1 μg的外源DNA；混勻后，37 ℃溫箱放置1 h，期間每隔10～15 min輕輕顛倒混勻；加入含亞致死濃度的相應(yīng)抗生素的LB液體，37 ℃ 160 r/min振搖培養(yǎng)2～3 h后；10 000 r/min室溫離心4 min，取上清液400 μL重懸菌體沉淀，均勻涂布于含相應(yīng)濃度氯霉素的LB平板上；次日觀察有無抗性菌落的出現(xiàn)，在光電折射儀上觀察菌落是否發(fā)出綠色熒光。挑取發(fā)綠色熒光的單菌落于含有氯霉素的液體LB中擴(kuò)大培養(yǎng)，并將該標(biāo)記菌株定名為LH-L3-P43GFPmut3a(以下簡稱為LH-L3-GFP)。

1.3 LH-L3-GFP與野生型LH-L3菌株的室內(nèi)拮抗活性比較

采用平板對峙實(shí)驗(yàn)[9]比較LH-L3-GFP和野生型LH-L3菌株對不同植物病原真菌的室內(nèi)拮抗活性，其中植物病原真菌以棉花黃萎病病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌為試驗(yàn)材料。觀察標(biāo)記菌是否具有相同或者更強(qiáng)的拮抗能力，對比兩者的拮抗帶寬度，以此來判斷其LH-L3-GFP是否適用于定殖研究。

1.4 LH-L3-GFP在棉花體內(nèi)的定殖

挑取過夜培養(yǎng)于氯霉素LB平板上的LH-L3-GFP的單菌落，于含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)3 d，形成抗逆性較強(qiáng)的內(nèi)生芽孢。棉花種子經(jīng)75%酒精表面消毒無菌水漂洗3次后，播種于經(jīng)2次滅菌的土壤中，約50 d后開始出現(xiàn)花朵時(shí)，用LH-L3-GFP菌液(106cfu/mL)進(jìn)行灌根處理，同時(shí)設(shè)定清水對照，每處理重復(fù)3次。

回收檢測菌LH-L3-GFP在根表土、根、莖、葉、花朵內(nèi)的定殖情況，分別于處理后1,3,5,7,10,25,50 d取樣。方法：將整棵棉花輕輕拔出，抖落根系上的土壤顆粒，然后用毛筆輕輕將附著在根系的土壤顆粒刷下，即為根表土壤樣品，稱質(zhì)量后依次加無菌水進(jìn)行10倍稀釋，取稀釋了100、1 000倍的土壤溶液100 μL均勻涂布于含有氯霉素抗性的平板上，每個(gè)處理重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)48 h。用無菌剪刀將根、莖、葉、花朵分開，其中從最下層葉片至基部的部分為莖，各部分別稱質(zhì)量后，棉株經(jīng)75%酒精浸泡2 min，無菌水漂洗3次后剪成小塊于無菌研缽中充分研磨至勻漿，然后進(jìn)行10倍稀釋，按上述方法每個(gè)濃度吸取100 μL涂布培養(yǎng)，菌落長出后，置于光電折射儀上統(tǒng)計(jì)綠色熒光的菌落數(shù)量，計(jì)算含菌量。

因生長至開花時(shí)的棉株根莖較硬，不易切片，所以按上述方法播種棉種后于棉株2葉期進(jìn)行澆菌處理。選擇處理第1天和第5天的棉株，用無菌水清洗表面泥土，采用徒手切片法制片，在激光掃描共聚焦顯微鏡(Leica，DE)下觀察GFP標(biāo)記菌株在棉株體內(nèi)的定殖情況。

1.5 LH-L3-GFP在不同作物體內(nèi)的定殖

該部分采用葉面涂抹菌液和灌根兩種接種方式進(jìn)行。將蠶豆、小麥、玉米和甘藍(lán)種子表面消毒后，于培養(yǎng)皿中進(jìn)行催芽，種子出芽3 d時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至離心管中，并使其根浸泡于4 mL水中，所用物品均經(jīng)過滅菌處理。

葉面涂抹接種：在確保葉片不被擦傷和離心管中的水不被污染的條件下，用滅菌棉棒蘸取菌液(濃度約為106cfu/mL)，輕輕涂抹幼苗的葉片。

灌根接種：加入400 μL菌液(濃度約為107cfu/mL)于離心管的水中。

將處理幼苗置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。于處理后24 h和72 h取樣，稀釋涂板檢測，方法與1.4一致。

2 結(jié)果

2.1 菌株LH-L3的自然轉(zhuǎn)化

按照上述方法，成功將質(zhì)粒pHT01-P43GFPmut3a導(dǎo)入LH-L3自然感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化成功的菌株能夠在終濃度為10 μg/mL的氯霉素平板上生長，且在光電折射儀上菌落發(fā)出綠色熒光(圖1)。

2.2 LH-L3-GFP與野生型LH-L3菌株的室內(nèi)拮抗活性比較

圖 1 光電折射儀下LH-L3的GFP標(biāo)記菌株 Fig.1 GFP-tagged LH-L3 under optical refract meter

野生型菌株LH-L3對多種植物病原菌都有較強(qiáng)的室內(nèi)拮抗活性，從圖2可以看出，與野生型相比較，LH-L3-GFP對病原真菌稻瘟病菌、玉米大斑病菌、黃萎病菌的拮抗力無明顯差異，可用于定殖和生物防治的研究。

2.3 LH-L3-GFP在棉花體內(nèi)和根際的回收監(jiān)測

W.T為LH-L3野生型菌株，GFP為LH-L3-GFPW.T mean wild type,GFP mean LH-L3-GFP strain圖2 LH-L3及其GFP標(biāo)記菌株的抑菌效果Fig.2 Inhibitory effect of LH-L3 and its GFP-tagged strain on fungal pathogens

通過灌根的方法，接種1 d后，標(biāo)記菌LH-L3-GFP在棉株各器官上的定殖如圖3-D、E、F，在激光共聚焦顯微鏡下清楚地觀察到主根伸長區(qū)、莖的薄壁組織，甚至葉部組織中都有標(biāo)記菌的存在；接種5 d后，熒光信號更加強(qiáng)烈，在莖表皮和皮層中大量聚集。在分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果與上述切片觀察的結(jié)果符合，由圖4可以看出在處理的第1天，標(biāo)記菌就能從下至上地侵入，在根表土、根、莖、葉、花朵等器官中回收到的菌落數(shù)分別為3.00×105，2.25×105，3.50×104，1.20×102，1.00×102cfu/g；第3、5天時(shí)，根表土中標(biāo)記菌數(shù)量有所下降，但至第7天時(shí)又出現(xiàn)緩慢上升趨勢，定殖數(shù)量一直維持在104～105cfu/g；根中標(biāo)記菌數(shù)量除第3天時(shí)有所下降，之后一直維持在105cfu/g左右；莖中標(biāo)記菌數(shù)量隨處理時(shí)間的延長有所變化，但定殖數(shù)量一直維持在104cfu/g左右；葉片和花朵中標(biāo)記菌數(shù)量變化不大，后期基本保持不變，均在101～102cfu/g。處理的第50天，仍然可以從棉株體內(nèi)和根表土中回收到標(biāo)記菌，說明該GFP標(biāo)記菌具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，同時(shí)說明菌株LH-L3能夠在棉花體內(nèi)穩(wěn)定定殖。

A、B、C分別為根、莖、葉對照；D、E、F分別為接種1 d后標(biāo)記菌在主根伸長區(qū)、莖的薄壁組織中、葉部組織中的定殖；G、H、I分別為接種5 d后標(biāo)記菌在主根伸長區(qū)、莖表皮和皮層的定殖、葉海綿組織的定殖A,B and C were root,steam and leaf control,respectively.D,E and F mean colonization in the main root elongation area,parenchyma of the stem and leaf tissue after 1 day of inoculation,respectively.G,H and I mean colonization in the main root elongation area,stem epidermis and cortex and leaf sponge tissue after 5 days of inoculation,respectively圖3 LH-L3-GFP在棉花根、莖、葉中的定殖Fig.3 The colonization of GFP-tagged strain,LH-L3-GFP in cotton root,stem and leaf tissues

2.4 LH-L3-GFP在不同作物體內(nèi)外的回收監(jiān)測

圖4 LH-L3-GFP在棉花體內(nèi)和根際的定殖Fig.4 The colonization of LH-L3-GFP in cotton parts and root rhizosphere

采用葉面涂抹和灌根的接種方式，分別檢測生防菌從葉片定殖至根部、根部定殖至葉片的情況。結(jié)果(圖5)顯示，葉面涂抹標(biāo)記菌24 h，菌株可到達(dá)這4種作物幼苗的莖部；處理72 h菌株可到達(dá)小麥、甘藍(lán)幼苗的根部，在蠶豆幼苗體內(nèi)的定殖能力最強(qiáng)，甚至在浸泡根部的水中都能回收到菌體，在玉米體內(nèi)的定殖能力稍弱，僅在葉片和莖部檢測到菌體的存在。采用灌根接種的方式，依然發(fā)現(xiàn)該菌株在蠶豆體內(nèi)定殖能力較強(qiáng)，處理24 h即可在莖部回收到菌體。除此之外，甘藍(lán)莖部也可回收到菌體，而菌株在小麥、玉米體內(nèi)仍然只存在于根部；處理72 h菌株均到達(dá)這4種作物莖部，葉片上回收不到菌體。因此，該菌株能在蠶豆、小麥、玉米、甘藍(lán)體內(nèi)定殖，其中在蠶豆體內(nèi)的定殖能力比在其他3種作物體內(nèi)的定殖更強(qiáng)。

A、B分別為葉面涂抹接種24，72 h標(biāo)記菌在不同作物體內(nèi)和體外的回收菌體數(shù)量；C、D分別為灌根接種24，72 h標(biāo)記菌在不同作物體內(nèi)和體外的回收菌體數(shù)量A and B mean the number of bacteria collected in different crops applied to the leaves for 24 hours and 72 hours,respectively.C and D mean the number of bacteria collected in different crops after drenching inoculation for 24 h and 72 h,respectively 圖5 LH-L3-GFP在不同作物體內(nèi)和體外的定殖Fig.5 The colonization of LH-L3-GFP in different crops

3 討論

從人類意識到化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境造成的嚴(yán)重危害開始，生物防治就越來越受到重視。目前，有益微生物介入在生物防治領(lǐng)域占有重要地位。這種措施能在改善作物生長和產(chǎn)量的同時(shí)確保人們消費(fèi)和生態(tài)環(huán)境的安全[10]。生防菌在根際土壤或植株體內(nèi)中不能成功地定殖，其他所有的抑菌機(jī)制都沒有真正的生防價(jià)值[11]。因此，研究菌株LH-L3在棉株及不同作物上的定殖情況極其重要。

目前，在對生防菌株定殖能力的檢測中，使用較多的為抗生素標(biāo)記法[12]和GFP標(biāo)記法。與抗生素標(biāo)記法相比，GFP 標(biāo)記法具有易于檢測、靈敏度高、穩(wěn)定性較好、構(gòu)建載體方便等優(yōu)點(diǎn)，從而受到了科研工作者的廣泛應(yīng)用[13]。由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的GFP質(zhì)粒pHT01-P43GFPmut3a，其芽孢桿菌復(fù)制子來源于低拷貝枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pBS72。用該質(zhì)粒對菌株進(jìn)行GFP標(biāo)記，所得菌株穩(wěn)定性較高。近2個(gè)月的取樣調(diào)查中依然能在玉米組織中回收到標(biāo)記菌，并且標(biāo)記菌株生長速率較快[8]。本實(shí)驗(yàn)室已使用該質(zhì)粒對多個(gè)生防菌株進(jìn)行標(biāo)記[14]，成為同時(shí)具有熒光特性和氯霉素抗性的標(biāo)記菌。

本次實(shí)驗(yàn)基于前人的基礎(chǔ)上，成功對菌株LH-L3進(jìn)行了GFP標(biāo)記，并采用澆灌菌液的方法，研究標(biāo)記菌株LH-L3-GFP在棉株體內(nèi)的定殖，結(jié)果顯示菌株在24 h就實(shí)現(xiàn)了自下而上的轉(zhuǎn)移，定殖能力由大到小依次為根、莖、花朵和葉，數(shù)量呈現(xiàn)“減—增—減”的變化趨勢，且根部數(shù)量變化波動不大，在跟蹤了近兩個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，菌株在棉株的各個(gè)器官內(nèi)均還能檢測出，表明LH-L3菌株在棉株體內(nèi)定殖情況較好。

此外，筆者還研究了菌株在蠶豆、玉米、小麥、油菜上的定殖能力。結(jié)果顯示菌株在這4種作物上均能定殖，定殖能力由大到小依次為蠶豆、甘藍(lán)、小麥和玉米。涂葉72 h能在整株蠶豆、甚至培養(yǎng)的水中檢測出菌的存在，灌根24 h能在蠶豆和甘藍(lán)的莖中檢測出菌的存在。出現(xiàn)這種差異可能與棉花、蠶豆、甘藍(lán)都屬于雙子葉作物有關(guān)，因此猜測該菌株在雙子葉作物體內(nèi)的定殖能力優(yōu)于單子葉作物。而通過灌根接種，在這4種植株葉片上均回收不到菌體，這也有可能是因?yàn)榈竭_(dá)葉片里的菌量較少，而筆者仍然用同一尺度進(jìn)行檢測，經(jīng)過研磨稀釋后導(dǎo)致濃度過低未檢測出來，具體原因仍有待進(jìn)一步探究。LH-L3的良好定殖能力，為其用于多種作物病害生物防治和促生長提供了條件。