超聲波輔助酶解制備東海海參膠原蛋白低聚肽及其活性的研究

徐紅萍，謝 輝，梁建灝，尹 嘯，金火喜

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022）

東海海參（海地瓜，Acaudina molpadioides），是我國20多種可供食用的海參之一，盛產(chǎn)于東海海區(qū)，特別是寧波、舟山沿海一帶有廣泛分布。東海烏參營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值與北方刺參類似[1]，富含蛋白質(zhì)、海參皂苷、海參多糖、膠原蛋白等成分。然而，由于缺乏產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)，東海海參市場價(jià)格低下，有些甚至在捕撈后被直接作為廢棄物丟棄。

東海海參體壁中含有豐富的膠原蛋白，具有良好的生物活性及生物功能。然而，由于其分子量很大，不利于腸胃和皮膚的吸收，限制其生物活性的發(fā)揮。因此，人們把目光投向了小分子的膠原蛋白多肽。膠原蛋白多肽不僅具有抗氧化、降血壓、抗菌和抗腫瘤等生物活性[2-3]，而且易于消化吸收，食用安全。海參膠原蛋白肽是天然的抗氧化劑，對超氧陰離子（O2·-）、羥基自由基（·OH）等均能有效地清除。研究表明，海參膠原蛋白肽抗氧化性的強(qiáng)弱與蛋白肽的分子量有關(guān)，表現(xiàn)出分子量越小，抗氧化活性越強(qiáng)的規(guī)律[4]。如不同分子量海地瓜蛋白肽中，分子量小于3 kDa的組分抗氧化活性最強(qiáng)，隨著多肽分子量的增加，抗氧化活性逐漸減弱[5]；不同分子量范圍的東海海參膠原蛋白肽中，分子量小于5 kDa的組分自由基清除率最大，達(dá)90%以上[6]。然而，東海海參體壁的肌纖維絲較粗壯，排列凌亂，纖維絲排列緊密，傳統(tǒng)的酶解方法水解度低、產(chǎn)品分子量分布寬、低聚肽含量較低[7-8]。

據(jù)此，本文以東海海參膠原蛋白為原料，在超聲波的輔助下進(jìn)行酶解制備低聚肽（分子量Mw＜1 kDa），并研究該低聚肽的抗氧化活性，為東海海參資源的開發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

東海海參（浙江省舟山市京洲水產(chǎn)食品有限公司），堿性蛋白酶（≥2 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；木瓜蛋白酶（≥2 000 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胃蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；中性蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胰蛋白酶（≥2 500 U/mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；福林酚試劑（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），牛血清蛋白（生工生物工程（上海）股份有限公司），其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

粉碎機(jī)（BRS-200、安徽博進(jìn)化工機(jī)械有限公司），高速離心機(jī)（TGL-16M、上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），冷凍干燥機(jī)（FD-1C、北京德天佑科技發(fā)展有限公司），過濾儀（MSC300、上海摩速科學(xué)器材有限公司），超濾膜（MSC80005、上海摩速科學(xué)器材有限公司），超聲波儀器（XH-300A、北京祥鵠科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 東海海參膠原蛋白的提取

東海海參樣品用水沖洗，去除泥沙、內(nèi)臟后，切成小塊，用0.2 M EDTA（pH 8.0）浸泡攪拌2 d，每12 h更換溶液。水洗后，用勻漿機(jī)勻漿20 min，離心后加入10倍體積的0.1 M Tris-HC（lpH 8.0），攪拌提取48 h。離心后加入10倍體積的0.1 M NaOH攪拌48 h，每12 h更換溶液，除去非膠原物質(zhì),10 000 r/min離心15 min。棄去上清液，沉淀物加10倍體積的0.5 M醋酸浸泡48 h，每12 h更換溶液，紗布過濾除去不溶雜質(zhì)。濾液在蒸餾水中透析48 h，透析液冷凍干燥即得膠原蛋白。

1.3.2 東海海參膠原蛋白低聚肽的制備

稱取0.2 g膠原蛋白于20 mL緩沖液中，加入0.1%（w/v）堿性蛋白酶酶解0.5 h，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，在超聲波輔助下（功率50、100、150、200、300 W），分別加入木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶10 mg水解30 min，得酶解液A。依次選取截留分子量為5 kDa和1 kDa的超濾膜對酶解液A進(jìn)行超濾處理，得酶解液B。將酶解液B冷凍干燥，即得東海海參膠原蛋白低聚肽干粉。

1.3.3 低聚肽含量測定

采用福林酚試劑法測定酶解液中多肽的含量。配制一系列梯度的牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液，以水作參比，分別與福林酚試劑反應(yīng)30 min，500 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將酶解液A和B按照相同步驟進(jìn)行操作，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線求解得出多肽含量。

低聚肽含量（%）=酶解液B中的蛋白含量/酶解液A中的蛋白含量×100低聚肽得率（%）=酶解液B凍干粉克數(shù)/0.2×100

1.3.4 DPPH清除率測定

稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配置成濃度為0.04 mol/mL的溶液。向1 mL樣品溶液中加入2 mL DPPH溶液混合均勻，避光室溫下放置30 min后，5 000 r/min離心5 min，取上清液，517 nm處測吸光值。

A0：1 mL H2O+2 mL DPPH溶液+1 mL無水乙醇；

A1：1 mL樣品+2 mL DPPH溶液+1 mL無水乙醇；

A2：1 mL樣品+2 mL無水乙醇+1 mL無水乙醇。

1.3.5 ABTS清除率測定

取440 μL濃度為140 mM的過硫酸鉀溶液與25 mL濃度為7 mmol/L的ABTS+的溶液兩者混合避光反應(yīng)14 h，用甲醇稀釋到吸光度為0.7±0.002作為工作液。取0.15 mL樣品溶液，加入2.85 mL ABTS自由基工作液混合避光反應(yīng)10 min，734 nm處測吸光值。

A溶劑：為2.85 mL ABTS溶液與0.15 mL甲醇混合后吸光度；

A樣品：為2.85 mL ABTS溶液與0.15 mL樣品混合后吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波功率對東海海參膠原蛋白酶解的影響

本試驗(yàn)采用超聲波輔助法酶解東海海參膠原蛋白，分別考察了超聲波功率對木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解東海海參膠原蛋白的影響。

超聲波輔助對木瓜蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響如圖1，可以看出超聲波輔助對木瓜蛋白酶酶解海參膠原蛋白有顯著效果，其低聚肽含量和收率均有明顯上升。當(dāng)功率為150 W時(shí)，低聚肽收率達(dá)到最大，比無超聲波輔助提高了32.2%。低聚肽含量峰值出現(xiàn)在200 W，比無超聲波輔助提高了82.3%。當(dāng)超聲波功率加大到300 W時(shí)，收率和含量分別為24.7%和66.1%。

圖2結(jié)果顯示，超聲波輔助對胃蛋白酶水解海參膠原蛋白也有明顯的促進(jìn)效果，低聚肽含量和收率均有顯著上升。當(dāng)超聲波功率為100 W時(shí)，低聚肽收率達(dá)到最大，比空白組提高了31.7%；當(dāng)功率為150 W時(shí)低聚肽含量則達(dá)到峰值的66.0%，比空白組提高了52.8%。隨后，跟圖1結(jié)果相似，超聲波功率的進(jìn)一步增加對低聚肽含量和收率會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。

圖1 超聲波功率對木瓜蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by papain

圖2 超聲波功率對胃蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by pepsin

超聲波功率對胰蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響如圖3。從圖3可以看出，當(dāng)功率為100 W時(shí)，低聚肽收率達(dá)最高值（相比無超聲組提高了27.7%），但與150 W時(shí)相差不大；而當(dāng)超聲波功率為100、150或200 W時(shí)，低聚肽含量較高，達(dá)到60.5%以上，比無超聲組提高了71.4%以上。

超聲波對中性蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響與上述三種情況略有不同（圖4），表現(xiàn)為低聚肽收率最高值出現(xiàn)在較高功率（200 W），而低聚肽含量峰值則出現(xiàn)在較低功率處（100 W）。與無超聲組相比，低聚肽收率和含量分別提高了19.5%和42.7%。

圖3 超聲波功率對胰蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by trypsin

圖4 超聲波功率對中性蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

目前，利用超聲波輔助酶解各類蛋白制備多肽的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。李楊等[9]采用超聲輔助酶解紅豆，結(jié)果多肽得率有顯著提高；夏陳等[10]采用超聲波輔助木瓜蛋白酶水解魚鱗膠原蛋白，水解度由16.6%提高到25.6%。在本試驗(yàn)中，超聲波輔助對木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解東海烏參膠原蛋白均有促進(jìn)作用，可顯著提高低聚肽含量和收率。無超聲波輔助時(shí)，胰蛋白酶酶解后的低聚肽收率和含量最低，中性蛋白酶最高。然而，超聲波輔助后，胰蛋白酶的低聚肽收率和含量分別提高了27.7%和74.5%，中性蛋白酶則只提高了19.5%和42.7%。低聚肽收率和含量提高幅度最大的是木瓜蛋白酶，分別達(dá)到32.2%和82.3%。造成這種差異可能是因?yàn)槌暡ㄝo助后，東海海參膠原蛋白部分隱藏在內(nèi)部的氨基酸殘基暴露，而上述蛋白酶的水解位點(diǎn)各有不同，從而水解程度不同。當(dāng)超聲波功率達(dá)到300 W時(shí)，4種蛋白酶酶解后低聚肽收率和含量均有不同程度的下降，造成這種結(jié)果的原因可能是超聲波功率太大，對蛋白酶結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致酶變性失活?？紤]到中性蛋白酶水解后低聚肽含量最高，達(dá)70.5%，故后續(xù)采用中性蛋白酶進(jìn)行酶解。

2.2 溫度對東海海參膠原蛋白酶解的影響

由于本試驗(yàn)是在超聲波處理的同時(shí)進(jìn)行酶解反應(yīng)，所以酶解的溫度也即為超聲波處理的溫度?？疾炝藴囟葘χ行缘鞍酌杆鈻|海海參膠原蛋白的影響，如圖5。隨著酶解溫度的上升，低聚肽含量和收率均不斷提高，直到60℃達(dá)到最高值。這與文獻(xiàn)報(bào)道的中性蛋白酶酶解的最適溫度（50～55℃）有所差異，可能是較高溫度下，超聲波的效果占主導(dǎo)因素。若繼續(xù)提高溫度，中性蛋白酶失活將占主導(dǎo)，導(dǎo)致酶解效果變差，故選擇60℃為酶解溫度。

2.3 pH對東海海參膠原蛋白酶解的影響

pH是影響酶催化反應(yīng)的重要因素，故本試驗(yàn)對反應(yīng)pH進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如圖6所示，低聚肽含量和收率開始隨著pH的增大而明顯升高，在pH 7.0達(dá)到最大；隨著pH繼續(xù)增大，低聚肽含量和收率開始降低。這是由于過酸和過堿都會(huì)對中性蛋白酶的結(jié)構(gòu)造成破壞，引起酶活性的下降，故選擇7.0為中性蛋白酶酶解pH值。

圖5 反應(yīng)溫度對中性蛋白酶酶解膠原蛋白的影響Fig.5 Effect of temperature on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

2.4 酶量對東海海參膠原蛋白酶解的影響

從圖7可以看出，隨著中性蛋白酶添加量的增加，低聚肽含量和得率逐漸升高；當(dāng)酶添加量為5%時(shí)，低聚肽含量和收率達(dá)到峰值；繼續(xù)加大酶量，低聚肽含量和收率基本趨于穩(wěn)定。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對東海海參膠原蛋白酶解的影響

在中性蛋白酶添加量5%，溫度60℃，pH 7.0條件下，考察了水解時(shí)間對低聚肽含量和收率的影響，結(jié)果如圖8所示。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，低聚肽含量和收率不斷上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為20 min時(shí)，低聚肽含量和收率達(dá)到最高值，分別為75.4%和52.9%。隨著反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長，低聚肽含量和收率略有下降，這可能是因?yàn)橛猩俨糠值途垭谋贿M(jìn)一步水解成氨基酸。

海參體壁含有豐富的膠原蛋白，很多學(xué)者通過酶解制備小分子肽，從而改善其難于被體內(nèi)吸收的特性。王天明等[5]利用胰酶和木瓜蛋白酶雙酶解海地瓜，酶解液中小分子肽（＜3 kDa）含量達(dá)到43.9%；蘇永昌等[7]利用中性蛋白酶對地瓜參進(jìn)行酶解，在最佳酶解工藝條件下，多肽得率僅為6.9%。本文采用超聲波輔助酶解，在最佳酶解條件下，酶解液中低聚肽（＜1 kDa）含量達(dá)到75.4%，收率最大達(dá)52.9%，大大提高了酶解效率。

2.6 東海海參膠原蛋白低聚肽的體外抗氧化性能

研究發(fā)現(xiàn)，海參蛋白肽具有顯著的抗氧化功能。陳卉卉等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，用木瓜蛋白酶水解東海海參膠原蛋白得到的多肽具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，其中分子質(zhì)量小于5 kDa的多肽抗氧化能力最強(qiáng)，羥基自由基和超氧自由基的清除率分別達(dá)93.1%和88.5%。肖楓等[11]利用菠蘿蛋白酶水解海棒槌膠原蛋白，所得產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)到52.20%。趙玲等[12]對4種海參多肽抗氧化活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)4種海參多肽對DPPH清除率順序是：刺參＞加州擬刺參＞東海海參＞大西洋海參；袁坤山等[13]利用堿性蛋白酶酶解白肛海地瓜蛋白制備抗氧化肽，得到的多肽對DPPH的清除率達(dá)到20.6%。本試驗(yàn)測定了不同濃度下東海海參低聚肽的DPPH和ABTS清除率，結(jié)果如圖9所示：隨著東海海參膠原蛋白低聚肽濃度的增加，DPPH和ABTS清除率均逐漸增大，其中ABTS的清除率較DPPH更高。當(dāng)?shù)途垭臐舛却笥? mg/mL時(shí)，ABTS的清除率均在80%以上；當(dāng)?shù)途垭臐舛葹? mg/mL時(shí)，DPPH和 ABTS的清除率分別為 21.1%和87.2%。

選擇低聚肽濃度為8 mg/mL，進(jìn)一步考察了DPPH和ABTS清除率隨著處理時(shí)間的變化情況。從圖10可以看出，ABTS的清除率在5 min時(shí)即達(dá)到80.7%，隨后隨著處理時(shí)間的延長，清除率趨于平緩。DPPH的清除率隨著時(shí)間的延長則逐步增加，由5 min時(shí)的3.0%提高到30 min時(shí)的19.0%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，東海海參膠原蛋白低聚肽對ABTS的清除效率顯著高于DPPH，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[14]。

圖6 pH對中性蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.6 Effect of pH on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

圖7 中性蛋白酶的添加量對酶解海參膠原蛋白的影響Fig.7 Effect of adding amount of neutral protease on hydrolysis of A.molpadioides collagen

圖8 反應(yīng)時(shí)間對中性蛋白酶酶解海參膠原蛋白的影響Fig.8 Effect of reaction time on hydrolysis of A.molpadioides collagen by neutral protease

圖9 低聚肽濃度對DPPH和ABTS清除的影響Fig.9 Effect of oligopeptide concentrations on removal of DPPH and ABTS

3 結(jié)論

本文以東海海參膠原蛋白為原料，以低聚肽（分子量＜1 kDa）含量和收率為指標(biāo)，首次采用超聲波輔助酶法制備東海海參膠原蛋白肽。在堿性蛋白酶酶解后，分別采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行二次酶解，考察了超聲波功率對酶解后低聚肽的含量和收率的影響。結(jié)果說明，超聲波輔助處理對4種蛋白酶酶解東海海參膠原蛋白均有顯著促進(jìn)作用。綜合考慮低聚肽含量和收率，選擇中性蛋白酶為最適酶，最佳超聲波功率為100 W。然后對超聲波輔助下中性蛋白酶酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度60℃，酶解pH 7.0，酶添加量5%（w/w），酶解時(shí)間20 min。在最佳工藝條件下，低聚肽含量和收率最大達(dá)75.4%和52.9%。該低聚肽清除DPPH和ABTS的效果均隨低聚肽濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)?shù)途垭臐舛葹? mg/mL時(shí)，DPPH和ABTS的清除率分別為21.1%和87.2%。DPPH和ABTS的清除率與時(shí)間曲線表明，東海海參膠原蛋白低聚肽對ABTS的清除非常迅速，而對DPPH的清除則隨處理時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)。后續(xù)將對該低聚肽進(jìn)行分離，以獲得活性較高的單一肽，并進(jìn)行氨基酸序列測定。

圖10 處理時(shí)間對DPPH和ABTS清除率的影響Fig.10 Effect of treatment time on DPPH and ABTS clearance rates