澳洲堅(jiān)果黑果病病原鑒定及防治藥劑毒力測試

蔣桂芝，周 程，李子強(qiáng)，趙 紅，賀熙勇

（云南省熱帶作物科學(xué)研究所，云南景洪666100）

澳洲堅(jiān)果（Macadamia integrifolia）是目前云南熱區(qū)繼橡膠樹之后的又一大面積種植的經(jīng)濟(jì)作物，至2015年種植面積已達(dá)12.25萬hm2、收獲面積6780.4 hm2，分別占全國種植總面積的95.38%和79.08%［1］。隨著澳洲堅(jiān)果種植時(shí)間的延長和面積的不斷增加，病蟲害種類逐漸增多，有的日漸嚴(yán)重。2017年7月和2018年6月，我們在澳洲堅(jiān)果病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)一種果實(shí)病害，癥狀表現(xiàn)為果實(shí)變黑壞死，表面長出大量橙紅色毛狀物（圖 1a，b），病果不脫落，我們暫定為“黑果病”。其癥狀與 Tony Cooke［2］、李加智［3］、蔡志英［4］等報(bào)道過的炭疽菌、擬莖點(diǎn)霉、黑孢霉等侵染引起的澳洲堅(jiān)果果腐病癥狀有明顯不同:炭疽菌引起果病癥狀主要表現(xiàn)為塊狀黑斑，病果大部分都會(huì)脫落，空氣濕度大時(shí)病斑上長出桔紅色的分生孢子堆；擬莖點(diǎn)霉、黑孢霉等引起的果腐病病果上不易產(chǎn)生分生孢子。我們特對(duì)病果采樣進(jìn)行病原分離鑒定，并進(jìn)行了防治藥劑室內(nèi)篩選，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下，以期為該病害的進(jìn)一步研究和防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

病原分離材料:取自云南省熱帶作物科學(xué)研究所景哈澳洲堅(jiān)果種植基地。

PDA培養(yǎng)基:土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，水1000 mL。

PDYA培養(yǎng)基:土豆200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉17 g，水1000 mL。

分子鑒定材料:真菌菌絲DNA快速抽提試劑盒、ITS1/ITS4 PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司提供。

試驗(yàn)接種材料:云南省熱帶作物科學(xué)研究所澳洲堅(jiān)果種質(zhì)圃內(nèi)正常、無病斑的未成熟果。

毒力測試藥劑:50%多菌靈WP（50%Carbendazim，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司），250 g/L嘧菌酯懸浮劑（250 g/L Azoxystrobin，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司），75%百菌清WP（75%Chlorothalonil），50%異菌脲WP（50%Iprodione，美國富美實(shí)公司），70%甲基硫菌靈WP（70%Thiophanate-Methyl，日本日友商社（香港）有限公司），80%代森錳鋅WP（80%Mancozeb，北京燕化永樂生物科技股份有限公司），450 g/L咪鮮胺水乳劑（450 g/L Prochloraz，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司），10%苯醚甲環(huán)唑分散劑（10%Difenoconazole，先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司），250 g/L丙環(huán)唑乳油（250 g/L Propiconazole，先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司），50%克菌丹可濕性粉劑（50%Captan，安道麥馬克西姆有限公司），58%甲霜·錳鋅WP（10%Metalaxyl+48%Mancozeb，江蘇寶靈化工股份有限公司），240 g/L戊唑醇懸浮劑（240 g/L Tebuconazole，德國拜耳公司生產(chǎn)），240 g/L噻呋酰胺懸浮劑（240 g/L Thifluzamide，北京華茂生物科技有限公司），20%噻菌銅懸浮劑（20%Thiediazole copper，浙江龍灣化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原分離及致病性測定

病原分離:病果用自來水表面清洗，再用75%酒精表面消毒2次，用滅菌刀片削去病斑及周圍表層皮，切取（3～5）mm×（3～5）mm病健交界組織，置于PDA平板，在25～28℃室溫下培養(yǎng)5 d。5 d后鏡檢長出的菌落，當(dāng)出現(xiàn)分生孢子后進(jìn)行單孢分離，在PDA平板上繼代培養(yǎng)得到病原純培養(yǎng)，編號(hào)，進(jìn)行致病試驗(yàn)。

致病性測試:測試菌在PDA平板25℃下培養(yǎng)5 d后，用滅菌刀將培養(yǎng)好的測試菌劃成為（3～5）mm×（3～5）mm的菌塊備用；接種堅(jiān)果用自來水表面清洗，再用75%酒精表面消毒后，用滅菌針分別在果實(shí)表面上扎3個(gè)孔，“品”字形排列，然后將備用菌塊長菌絲的一面貼在扎孔部位，菌塊上敷以濕棉，將接種果置于培養(yǎng)皿中，再放到保濕缸中在25～28℃室溫下培養(yǎng)5～7 d，觀察接種果感病情況。對(duì)照接無菌PDA瓊脂塊。5～7 d接種果感病后再分離病原菌，分離菌與接種菌形態(tài)一致時(shí)，確認(rèn)為病原菌。

1.2.2 病原鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

將經(jīng)過致病性測試的病原菌在PDA平板25℃室溫下培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落形態(tài)、顯微觀測和照相記錄，依據(jù)菌落形態(tài)、產(chǎn)孢方式，和莊文穎、Y.Hirooka［5-6］等的資料進(jìn)行比對(duì)鑒定。

（2）分子生物學(xué)鑒定

用DNA劑盒提取病原菌菌絲體的DNA。DNA提取物用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增，rDNA ITS區(qū)序列擴(kuò)增及分析采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引 物 ITS1（5′-TTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），擴(kuò)增該病原菌5.8 S rDNA及其兩邊的ITS1和ITS2基因片段。擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μL:真菌DNA模板（0.5～1.0）μL、10 μmol/L ITS1 1 μL、10 μmol/L ITS4 1 μL、2× Master Mix25 μL、ddH2O 10 μL，加水補(bǔ)至50 μL。 PCR 擴(kuò)增程序:預(yù)變性 94℃ 5 min；變性 94℃ 30 s，50℃ 45 s，72℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。測序:PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）有限公司完成測序。最后將測序得到的ITS序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫中有關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，確定其分類地位。

1.2.3 病原菌適宜生長溫度測試

病原菌PDA平板在25℃條件下培養(yǎng)5～7 d后，用打孔器打成直徑5 mm的圓形菌塊，然后將菌塊帶菌絲一面接種在PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃溫度、RH 80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，依據(jù)菌落生長情況確定病原菌的適生溫度。

1.2.4 藥劑毒力測試

按使用濃度配制各參試農(nóng)藥含毒培養(yǎng)基，農(nóng)藥含量分別為:嘧菌酯0.15 mg/L，多菌靈0.5 mg/L，苯醚甲環(huán)唑0.03 mg/L，百菌清0.5 mg/L，異菌脲0.3 mg/L，甲基硫菌靈0.5 mg/L，代森錳鋅0.8 mg/L，咪鮮胺0.8 mg/L，丙環(huán)唑0.5 mg/L，克菌丹1.0 mg/L，甲霜·錳鋅0.8 mg/L，戊唑醇0.1 mg/L，噻呋酰胺0.15 mg/L，噻菌銅1.0 mg/L。

將病原菌接種于含毒培養(yǎng)基平板，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察記錄菌落的生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

藥效顯著性分析用SPSS 21軟件、Duncan（D）法。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離和致病性測試

病原分離后得到純陪養(yǎng)菌株，編號(hào)OJ201712。

致病性測試:在25℃、RH 85%的條件下，堅(jiān)果接種OJ201712第3 d，表面接種點(diǎn)出現(xiàn)褐色水浸狀斑點(diǎn)，5 d后斑點(diǎn)擴(kuò)大呈黑褐色，15 d后果皮全部變成黑色，與田間癥狀相似（圖1 c），果皮表面長滿菌絲，20 d后在菌絲上長出大量橙黃色分生孢，未見束絲梗生成；對(duì)照不感?。▓D1 d）。試驗(yàn)證實(shí)OJ201712是造成澳洲堅(jiān)果黑果病的病原菌。經(jīng)觀察，接種致病果皮上菌絲生長旺盛，但未見生成束絲梗，這也許是試驗(yàn)的濕度、溫度條件還不能滿足束絲梗的形成。

2.2 病原鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上，菌落產(chǎn)生淺紅色色素（圖2 a），孢子著生在孢子梗上，孢子梗不分枝，直立，近圓柱形，頂部漸尖（圖2 b）；培養(yǎng)15 d后，菌落表面產(chǎn)生疣狀物，散生或聚生、表生，初期為橘黃色，后漸呈橙色并形成為束絲梗，產(chǎn)生大量的分生孢子（圖2 c）；分生孢子卵形、橢圓形、長橢圓形，無隔，表面平滑，無色，（4.0～6.2）μm×（2.2～3.6）μm（圖2 d）；在PDYA培養(yǎng)基上，分生孢子在孢子梗頂端聚集呈頭狀（圖2 e）。根據(jù)形態(tài)特征鑒定為叢赤殼科叢赤殼屬假毛叢赤殼菌Nectria pseudotrichia。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定

從OJ201712菌絲體中提取DNA，經(jīng)ITS1/ITS4引物擴(kuò)增、測序，獲得575 bp ITS序列（登錄號(hào)為MG557984），ITS序列與真菌核酸數(shù)據(jù)庫GenBank中已公布的2株叢赤殼菌的ITS序列（HM48455.4、KU940138.1）同源性均為99%，因此鑒定為假毛叢赤殼菌。

形態(tài)鑒定與分子鑒定一致，確認(rèn)OJ201712為假毛叢赤殼菌N.pseudotrichia。

2.3 適宜溫度測定

根據(jù)測試結(jié)果（表1）可知，OJ201712培養(yǎng)溫度為20℃時(shí)的菌絲平均生長量最大，達(dá)61.3 mm，漸次為25℃平均生長量47.7 mm，30℃平均生長量45.0 mm，15℃平均生長量20.0 mm；即生長溫度范圍10～35℃，適宜生長溫度為15～30℃，最適生長溫度為20℃。在2.1致病性測試中，其接種培養(yǎng)溫度（25℃）正值OJ201712適宜生長溫度范圍，因而接種果皮菌絲生長旺盛，與適宜溫度測試結(jié)果相一致。

表1 OJ 201712不同溫度條件菌絲平均生長量 m m

2.4 藥劑毒力測試

藥效測試結(jié)果（表2）顯示，在0.01水平上參試藥劑藥效差異顯著，其中咪鮮胺（I）、丙環(huán)唑（I）、多菌靈（I）對(duì) OJ201712的抑制效果最好，能有效控制菌絲生長，其它漸次為戊唑醇（H）、異菌脲（G）、甲基硫菌靈（F）、克菌丹（F）、苯醚甲環(huán)唑（E）、百菌清（E）、甲霜·錳鋅（E）、甲霜·錳鋅（DE）、嘧菌酯（D）、代森錳鋅（C）、噻呋酰胺（B），均表現(xiàn)有一定效果。50%多菌靈、450 g/L咪鮮胺、250 g/L丙環(huán)唑乳油等3種藥劑可推薦用于田間防治試驗(yàn)。

3 討論

由假毛叢赤殼菌（N.pseudotrichia）引起澳洲堅(jiān)果果實(shí)病害尚屬首次報(bào)道，暫名澳洲堅(jiān)果黑果?。∕acadamia black fruit disease）。該病一般于每年5-9月雨季（空氣濕度大）時(shí)發(fā)生，秋后在殘留的果梗上也易見到病果。有資料報(bào)道，假毛叢赤殼菌N.rugulosa可引起梨的莖干潰瘍?。?］，澳大利亞的澳洲堅(jiān)果樹衰退?。?］和夏威夷的澳洲堅(jiān)果樹莖腐?。?］。N.rugulosa與N.pseudotrichia為同屬不同的種，均能對(duì)澳洲堅(jiān)果樹致病為害，兩者所致病害的差異或許是出于地域不同的原因。假毛叢赤殼菌在我國分布于浙江、福建、湖北、廣東、海南、臺(tái)灣［6］，為熱帶常見的種。我國澳洲堅(jiān)果種植區(qū)分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，每年的10月至翌年的3月一般日氣溫15～30℃，4-9月21～35℃，均與假毛叢赤殼菌適宜生長溫度相符，有利于假毛叢赤殼菌的生長。可以預(yù)見，假毛叢赤殼菌對(duì)澳洲堅(jiān)果的為害可能會(huì)隨著種植時(shí)間的延續(xù)呈逐漸加重的趨勢，還有可能對(duì)樹體其它部位侵染致病。澳洲堅(jiān)果果實(shí)生長期間會(huì)經(jīng)常性地受到蝽類、薊馬、蚜蟲等刺吸式口器害蟲為害，造成傷口，在濕熱的天氣條件下易引起果實(shí)感病，因此控制害蟲的蟲口密度可能是控制本病發(fā)生的一項(xiàng)重要措施。

表2 藥效測試結(jié)果