乙醇作用時(shí)間對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜損傷的影響

南楠，梁敏，劉婷婷，陳西華，王樹芳，汪坤，祝立權(quán)，張博男，賀斌，徐祥波*

(1.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

子宮內(nèi)膜的修復(fù)障礙大部分由炎癥和手術(shù)所致[1]，而主要原因是流產(chǎn)時(shí)刮宮術(shù)引起的子宮損傷導(dǎo)致的宮腔粘連。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，造成宮腔粘連的手術(shù)類型以妊娠期手術(shù)操作最多，占比93.01%，其中早孕期清宮占比54.59%[2]。宮腔粘連是指子宮的創(chuàng)傷導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層受損，使宮腔部分或全部閉塞從而導(dǎo)致月經(jīng)異常、不孕或反復(fù)流產(chǎn)等。不孕不育是生殖領(lǐng)域亟需解決的一大問題，而胚胎和子宮是成功妊娠的兩個(gè)重要因素。宮腔粘連是導(dǎo)致妊娠失敗子宮方面的主要因素[3-4]，給許多女性生活帶來極大的困擾。目前，宮腔粘連形成的確切機(jī)制尚不清楚。

子宮內(nèi)膜損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立是研究薄型子宮內(nèi)膜/宮腔粘連的重要平臺(tái)。本研究中，根據(jù)以往對(duì)子宮損傷模型相關(guān)文獻(xiàn)的閱讀[5]，參考已經(jīng)使用得比較成熟的對(duì)大鼠子宮造成化學(xué)損傷的試劑，我們采用95%乙醇損傷大鼠子宮內(nèi)膜，觀察95%乙醇不同作用時(shí)間下子宮內(nèi)膜的損傷修復(fù)情況，旨在探討不同乙醇作用時(shí)間對(duì)子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的影響，以及建立優(yōu)化的大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8～10周齡性成熟且未交配的雌性SD 大鼠，SPF級(jí)，由北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]提供。于國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所[SYXK(京)2009-0033]飼養(yǎng)，室溫23～25℃，濕度67%～75%，光照明暗時(shí)間比為14 h/10 h，能自由獲取充足的食物和水。按照性周期一致性原則，每籠飼養(yǎng)3只大鼠。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑：95%乙醇(北京化工廠)，蘇木精-伊紅染液(北京中杉金橋)，天狼星紅染液(上海翊圣生物)

3.主要儀器：生物組織包埋機(jī)(浙江科迪儀器設(shè)備)，蠟塊切片機(jī)(Leica，德國(guó))，光學(xué)顯微鏡(Leica，德國(guó))，偏振光顯微鏡(上海蒲拓光電儀器)

二、研究方法

1.SD大鼠子宮內(nèi)膜損傷實(shí)驗(yàn)：將25只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組5只，一組僅開腹縫合作為對(duì)照組，另外4組為實(shí)驗(yàn)組，分別以95%乙醇作用15 s、30 s、60 s、120 s。用10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，注射劑量為3 ml/kg，麻醉后放入無菌手術(shù)臺(tái)，仰臥，消毒后腹部陰道口向上1 cm左右進(jìn)行開口，輕輕夾出V型子宮，用動(dòng)脈夾夾住子宮近陰道端，用注射器分別向子宮推入300～500 μl 95%乙醇，使子宮保持充盈狀態(tài)。作用結(jié)束后將95%乙醇吸出，并用生理鹽水洗滌子宮腔3遍，將子宮塞回，縫合傷口并消毒放回。每組5只大鼠。術(shù)后7 d 脫頸處死SD大鼠，獲取大鼠子宮，進(jìn)行拍照并固定于4%多聚甲醛。

2.組織形態(tài)學(xué)觀察：大鼠子宮組織于4%多聚甲醛固定后，取子宮中間部分進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度進(jìn)行切片，脫蠟，水化，進(jìn)行HE染色觀察子宮組織形態(tài)學(xué)，天狼星紅染色觀察其偏光鏡下纖維化程度。

3.腺體數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度統(tǒng)計(jì)和分析：每組大鼠子宮隨機(jī)選取5張切片進(jìn)行HE染色，計(jì)數(shù)每張片子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目，取其平均值。子宮內(nèi)膜厚度則是每組隨機(jī)選取5張切片，4個(gè)方向用顯微鏡測(cè)微尺測(cè)量厚度，求取每一張片子厚度平均值后，并求取5張片的子宮內(nèi)膜厚度平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本之間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、95%乙醇不同作用時(shí)長(zhǎng)下大鼠狀況

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的大鼠在術(shù)后1周內(nèi)狀態(tài)良好，眼神有光，毛色順亮，精神狀態(tài)良好，無死亡，飲食正常，排泄正常。

二、子宮形態(tài)學(xué)變化

1.大鼠子宮形態(tài)：術(shù)后7 d，對(duì)照組子宮較細(xì)，整體粗細(xì)均勻一致，外觀平整光滑，富有彈性(圖1A)；95%乙醇作用15 s組子宮與對(duì)照組無太大差異(圖1B)；作用30 s組子宮出現(xiàn)淤血，有水腫現(xiàn)象存在，管壁呈紅色子宮外觀較光滑(圖1C)；作用60 s組子宮管壁表面出現(xiàn)皺痕，有明顯淤血，子宮內(nèi)膜有出血?dú)埩舻难龎K(圖1D)；而作用120 s組子宮壁粗糙，形態(tài)不規(guī)則，且韌性極差，整個(gè)子宮均出現(xiàn)出血造成的血凝塊，損傷嚴(yán)重(圖1E)。

2.組織HE染色：相對(duì)于對(duì)照組(圖2A/a)，95%乙醇作用15 s組出現(xiàn)子宮內(nèi)膜纖維化，有輕度的宮腔黏連現(xiàn)象，部分子宮腔上皮脫落，癥狀較輕，腺體分布不規(guī)律，較紊亂(圖2B/b)；乙醇作用30 s組子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞已經(jīng)全部損傷，幾乎無腺體存在，出現(xiàn)更嚴(yán)重一些的宮腔粘連，子宮內(nèi)膜纖維化程度加重(圖2C/c)；乙醇作用60 s組子宮內(nèi)膜已經(jīng)開始出現(xiàn)凝固性壞死，子宮內(nèi)膜大面積損傷脫落，子宮宮腔變大，子宮內(nèi)膜基底層也受到了一定的影響(圖2D/d)；乙醇作用120 s組子宮內(nèi)膜腔上皮至基底層全部損傷，形成空腔，出現(xiàn)更大的面積的凝固性壞死，已形成不可修復(fù)的子宮內(nèi)膜的損傷(圖2E/e)。

A：對(duì)照組；B～E：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s圖1 95%乙醇不同作用時(shí)長(zhǎng)下大鼠子宮形態(tài)的比較

A、a：對(duì)照組；B～E、b～e：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s(A～E為5倍視野下觀察結(jié)果，a～e為上圖標(biāo)注*處20倍視野下放大結(jié)果)圖2 95%乙醇作用不同時(shí)長(zhǎng)下的子宮內(nèi)膜形態(tài)(HE染色)

3.子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量和子宮內(nèi)膜厚度：子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量方面，與正常對(duì)照組相比，從95%乙醇作用15 s開始其腺體數(shù)目顯著減少(P<0.05)，至作用120 s時(shí)，鏡下已經(jīng)基本檢測(cè)不到腺體的存在(圖3A)，而各處理組之間腺體的數(shù)量無顯著差異(P>0.05)；在子宮內(nèi)膜厚度方面，乙醇作用15 s和30 s的處理組中大鼠子宮內(nèi)膜的厚度與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，隨后在95%乙醇作用60 s處理組中子宮內(nèi)膜開始變薄，至120 s大鼠子宮內(nèi)膜厚度均比正常對(duì)照組薄(圖3B)，并且與正常對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)。

NC：對(duì)照組；與對(duì)照組比較，*P<0.05圖3 95%乙醇作用不同時(shí)長(zhǎng)后腺體數(shù)目和子宮內(nèi)膜厚度的比較

4.組織天狼星紅染色：我們對(duì)大鼠子宮組織進(jìn)行切片，用天狼星紅染色。天狼星紅染液為強(qiáng)酸性染料，與膠原分子中的堿性基團(tuán)結(jié)合被染成紅色，在偏振光鏡下對(duì)纖維化病變分型和分級(jí)有幫助作用。從天狼星紅染色可以看出，95%乙醇的作用的確已經(jīng)對(duì)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生了損傷，并使子宮發(fā)生了纖維化(圖4A～E)。但是就天狼星紅結(jié)果而言，并未發(fā)現(xiàn)明顯的組間差異。

A：對(duì)照組；B～E：95%乙醇分別作用15 s、30 s、60 s、120 s圖4 95%乙醇作用不同時(shí)長(zhǎng)下的子宮內(nèi)膜形態(tài)(天狼星紅染色×4)

討 論

我們采用化學(xué)損傷法設(shè)計(jì)、建立和優(yōu)化大鼠子宮內(nèi)膜損傷模型。目前，子宮內(nèi)膜損傷模型建立的方法主要有熱損傷法[6]、吸宮法、電凝法[7]、機(jī)械損傷法[8]、化學(xué)損傷法[5]和聯(lián)合使用法[9]。其中熱損傷法利用的是“熱球”內(nèi)膜去除原理，手術(shù)置入宮腔導(dǎo)管，利用溫度造成子宮內(nèi)膜損傷；吸宮法是利用負(fù)壓對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行吸宮，造成損傷；電凝法是利用電擊的方法對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行損傷；機(jī)械損傷是利用刮匙對(duì)子宮內(nèi)側(cè)進(jìn)行刮傷；化學(xué)損傷法則是利用酒精對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行損傷。本研究經(jīng)過比較決定采用化學(xué)損傷的方法，建立子宮內(nèi)膜宮腔粘連模型。已有文獻(xiàn)報(bào)道用95%酒精建立了大鼠薄型子宮模型[10]和宮腔粘連酒精損傷模型[11]，作用時(shí)間分別為5 min和3 min。為了驗(yàn)證95%乙醇損傷子宮造模的最佳作用時(shí)長(zhǎng)，我們開始觀察和驗(yàn)證不同作用時(shí)間下的子宮內(nèi)膜狀態(tài)。

目前而言，做子宮內(nèi)膜損傷模型常用的動(dòng)物是兔子[12]、大鼠[13]和小鼠[14]。根據(jù)生長(zhǎng)周期，手術(shù)操作難易等各方面綜合考慮，我們決定采用大鼠。大鼠生長(zhǎng)周期較短，麻醉開口較簡(jiǎn)單，且子宮大小合適，手術(shù)方便，其動(dòng)情周期較規(guī)律易觀察。

本研究可看出，95%乙醇作用15 s的一組，其子宮子宮腔有部分損傷，且腺體減少，有纖維化現(xiàn)象；作用30 s后的子宮，腔上皮細(xì)胞全部脫落，且纖維化程度更加嚴(yán)重，基底層細(xì)胞排列凌亂，數(shù)量減少，存在一定的自我修復(fù)現(xiàn)象，且形成了宮腔粘連；而95%乙醇作用60 s和120 s的子宮形成較大的子宮腔，基層已經(jīng)受到一定或徹底的損傷，自我修復(fù)能力幾乎為零。根據(jù)與臨床觀察結(jié)果相比較，95%乙醇作用15～30 s的損傷程度能有效地模仿臨床刮宮效果，建立大鼠宮腔粘連模型。

另外，通過子宮內(nèi)膜腺體數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同乙醇作用時(shí)長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜的腺體數(shù)量明顯減少，說明95%乙醇能夠影響子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量。大鼠子宮內(nèi)膜厚度統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，95%乙醇作用時(shí)長(zhǎng)在15 s和30 s時(shí)子宮內(nèi)膜厚度與對(duì)照組相比并無太大變化，作用時(shí)長(zhǎng)在60 s時(shí)子宮內(nèi)膜厚度明顯比正常對(duì)照組薄，而作用時(shí)長(zhǎng)為120 s時(shí)子宮內(nèi)膜厚度僅為正常對(duì)照組的1/3左右。以往文獻(xiàn)報(bào)道，正常女性子宮壁厚度在10～10.6 mm左右[15]，對(duì)243例刮宮術(shù)術(shù)后患者子宮內(nèi)膜厚度分析，刮宮一次的患者子宮壁厚度均值在9.66～9.85 mm左右，刮宮兩次的患者其子宮壁厚度約在8.9～8.92 mm左右，刮宮三次及四次者其均值約在7.32～7.70 mm之間。因此，在本研究中，推薦在本動(dòng)物模型中95%乙醇處理時(shí)間在15～30 s之間最為合適，對(duì)子宮內(nèi)膜的損傷程度可能貼近臨床上的刮宮損傷程度，以滿足臨床不同程度內(nèi)膜損傷機(jī)理的研究。