棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究進展

周義杰，姜夢嫣，閆希煥，高亭豪，楊明峰 *，馬蘭青，3*

(1.北京農(nóng)學院植物科學技術(shù)學院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；2.北京農(nóng)學院生物科學與工程學院/農(nóng)業(yè)部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；3.北京農(nóng)學院北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

棗樹(Ziziphusjujuba)為鼠李科(Rhamhaceae)棗屬(ZiziphusMill.)植物，起源于黃河中下游[1]，至今已經(jīng)有3 000多年的栽培歷史[2]，是中國重要的果樹樹種之一，也是中國第一大干果樹種。2016年中國棗果實總產(chǎn)量達800萬t，約占世界總產(chǎn)量的99%，絕大部分棗產(chǎn)品國際貿(mào)易集中在中國[3]。棗果實素有“五果”(桃、李、梅、杏、棗)之稱[4]，一直深受中國人民的喜愛。其營養(yǎng)豐富，含有人體所需的多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等，其中維生素C含量在各種水果中名列前茅。

棗樹具有胚敗育率高[5]、花小且去雄困難[6]、落花落果嚴重、栽培品種種仁退化嚴重[7]、長期的無性繁殖、生長枝少[8]等獨特的生物學習性，大大限制傳統(tǒng)育種方法在棗樹上的應(yīng)用。而且棗樹受棗瘋病、棗黑斑病、棗縮果病等病害影響嚴重，給各地棗產(chǎn)業(yè)造成大量的經(jīng)濟損失。隨著生物技術(shù)不斷發(fā)展，植物細胞工程和基因工程技術(shù)正在成為現(xiàn)代植物品種改良的有效手段，利用這些技術(shù)進行棗樹的遺傳轉(zhuǎn)化，可以明顯縮短育種周期，定向改良棗樹品種，根據(jù)人們的實際需求創(chuàng)造出抗病、抗逆、營養(yǎng)價值高的優(yōu)良新品種。

1 棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的方法

目前，植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法有很多，一般分為三類。第一類是外源基因直接導入法，包括電穿孔法、基因槍法、激光微束穿孔法、體內(nèi)注射法、超聲波法等；第二類是載體介導法，主要包括農(nóng)桿菌介導法和病毒介導法；第三類是種質(zhì)轉(zhuǎn)化法，包括植物原位真空滲入法和花粉管通道法等，其中農(nóng)桿菌介導法因為其機理清楚、技術(shù)成熟、成功實例多而成為目前使用最多的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)[9]。在木本果樹轉(zhuǎn)化成功的例子中，80%以上采用農(nóng)桿菌介導法[10]。

棗樹的遺傳轉(zhuǎn)化相對其他果樹起步較晚，但也取得一定的成果[11]。何業(yè)華等以茶陵沙棗、雞蛋棗和寶玉等品種不同外植體為受體，將番茄ACC合成酶反義基因?qū)胧荏w細胞，旨在抑制乙烯的合成，創(chuàng)造耐貯存品種[12,13]；孟輝以沾化冬棗組培苗莖尖為受體，將大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和擬南芥的乙酰乳酸脫氫酶突變基因als導入冬棗細胞，旨在增加棗的耐鹽性和獲得對磺酰脲類除草劑的抗性[14]；黃建以木棗生根組培苗葉片為受體，將蘋果山梨醇-6-磷酸脫氫酶基因S6PDH導入木棗細胞，旨在使棗樹具有合成山梨醇的能力，提高棗樹的抗逆性[15]；郝征以冬棗組培苗葉片為受體，將改造的BtCrylAc基因及慈姑蛋白酶抑制劑基因API導入冬棗細胞，旨在提高棗樹的抗蟲能力[16]；芪合酶基因STS可以產(chǎn)生植保素白藜蘆醇，提高棗樹的抗病能力，Luo等以壺瓶棗莖段為受體，將虎杖芪合酶基因STS導入壺瓶棗細胞[17]；郭輝力以壺瓶棗莖段為受體，將擬南芥4-香豆酰輔酶A基因4CL和虎杖芪合酶基因STS融合后導入壺瓶棗細胞[18]。這些研究均使用根癌農(nóng)桿菌介導法，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系并獲得轉(zhuǎn)化植株。此外郝征將發(fā)根農(nóng)桿菌導入冬棗組培苗葉片和冬棗棗瘋病組培苗葉片，建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，旨在獲得抗棗瘋病植株[16]。

2 棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素

農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化一般有以下步驟：(1)建立植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；(2)對植物外植體進行切割，植物受傷后傷口部位分泌酚類物質(zhì)，如乙酰丁香酮(Acetosyringone, AS)和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)誘導農(nóng)桿菌向植物傷口部位移動；(3)農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的VirA/VirG信號系統(tǒng)特異性識別酚類物質(zhì)，誘導Vir區(qū)基因表達；(4)VirD1和VirD2蛋白切割Ti質(zhì)粒上的T-DNA左右邊界產(chǎn)生單鏈T-DNA分子；(5)T-DNA與蛋白質(zhì)形成復合體，從植物細胞外進入細胞質(zhì)進一步加工后進入植物細胞核；(6)T-DNA整合到植物基因組中。整個遺傳轉(zhuǎn)化過程步驟較多，每一步的優(yōu)化都有可能提高遺傳轉(zhuǎn)化效率[19]。

2.1 受體系統(tǒng)的建立

植物遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)是指外植體在植物細胞全能性的理論基礎(chǔ)之上，通過植物組織培養(yǎng)等方法，能夠穩(wěn)定高效再生為完整植株，并且植物細胞能夠接受外源DNA的導入、對轉(zhuǎn)化后進行選擇的抗生素或除草劑具有敏感性[20]。建立良好的受體系統(tǒng)是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。受體系統(tǒng)一般包括組織再生系統(tǒng)、原生質(zhì)體再生系統(tǒng)、胚狀體再生系統(tǒng)、生殖細胞受體系統(tǒng)等[21]。

組織受體系統(tǒng)是指利用植物的葉片、幼莖、子葉、胚軸等外植體培養(yǎng)獲得再生植株的受體系統(tǒng)，又分為愈傷組織再生系統(tǒng)和直接分化再生系統(tǒng)。愈傷組織再生系統(tǒng)是指外植體經(jīng)過脫分化形成愈傷組織，再分化獲得再生植株，具有轉(zhuǎn)化率高、外植體來源容易、轉(zhuǎn)化植株易擴繁等優(yōu)點，但其外源基因遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體(含有兩種或兩種以上遺傳型植物組織或個體)多。直接分化再生系統(tǒng)是指外植體直接分化出不定芽獲得再生植株，省去誘導愈傷和愈傷分化步驟，具有操作簡單、體細胞無性系變異小等優(yōu)點，但其轉(zhuǎn)化率低、嵌合體多[21]。早期有研究表明，棗樹愈傷組織培養(yǎng)時分化率一般低于15%[22]，對于遺傳轉(zhuǎn)化來說是遠遠不夠的，因此目前報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化工作基本都采用直接分化再生系統(tǒng)。

何業(yè)華等以茶陵沙棗嫩梢段和下胚軸為外植體，不定芽再生頻率達90%以上，分別獲得2.4%、4%的轉(zhuǎn)化率，另外，以雞蛋棗嫩梢段為外植體獲得2%的轉(zhuǎn)化率。下胚軸轉(zhuǎn)化率明顯高于嫩梢段，但常見的棗樹優(yōu)良品種果實成熟時胚已退化，無法使用下胚軸作為外植體，所以對于有胚品種可以優(yōu)先使用下胚軸作為轉(zhuǎn)化受體材料[12,13]。以莖尖為外植體建立的直接分化再生系統(tǒng)具有良好的遺傳穩(wěn)定性，孟輝以莖尖為外植體，獲得5.2%的轉(zhuǎn)化率[14]。黃建以木棗葉片為外植體，獲得2.4%的轉(zhuǎn)化率[15]。郝征以冬棗葉片為外植體，獲得8個轉(zhuǎn)基因株系[16]。Luo等[17]、郭輝力[18]以壺瓶棗莖段為外植體，分別獲得1.52%、1.83%的轉(zhuǎn)化率。

2.2 農(nóng)桿菌菌株的選擇

在農(nóng)桿菌侵染植物的過程中，根據(jù)菌株類型不同、植物不同，農(nóng)桿菌的侵染能力也有顯著差異。例如在蘋果遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，張志宏等[23]、秦玲等[24]發(fā)現(xiàn)同為琥珀堿型菌株的EHA105和A281的侵染能力明顯高于章魚堿型菌株LBA4404。王關(guān)林對多種菌株進行比較后認為，菌株EHA105具有生長快、侵染能力強、培養(yǎng)過程不結(jié)球、培養(yǎng)后易洗脫等優(yōu)點，更加適合作為果樹遺傳轉(zhuǎn)化載體[9]。

在已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，何業(yè)華、孟輝、郝征使用菌株LBA4404，黃建、Luo等、郭輝力使用菌株EHA105，均獲得成功[12-18]。

2.3 農(nóng)桿菌菌液濃度

農(nóng)桿菌菌液濃度的大小影響植物遺傳轉(zhuǎn)化效率。菌液濃度過低，能夠侵染植物細胞的農(nóng)桿菌太少，降低T-DNA進入植物細胞的幾率；菌液濃度過高時則會使農(nóng)桿菌進入衰亡期，大量菌體死亡，具有侵染能力的農(nóng)桿菌減少，同時死亡菌體釋放有害物質(zhì)對植物細胞生長造成不良影響。根據(jù)植物受體部位不同、農(nóng)桿菌菌種不同，用來侵染的農(nóng)桿菌菌液最適濃度也不同。在已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，菌液濃度一般在OD6000.5～0.8之間[12-18]。

2.4 農(nóng)桿菌侵染時間

農(nóng)桿菌侵染時間長短也是植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要影響因素。如果侵染時間過短，吸附在植物受傷部位的農(nóng)桿菌太少，無法有效完成T-DNA的轉(zhuǎn)移；如果侵染時間過長，農(nóng)桿菌對植物細胞的毒害作用使外植體缺氧軟腐而失去活性[20]。在已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，農(nóng)桿菌侵染時間一般在5～20 min之間[12-18]。

2.5 Vir區(qū)基因活化誘導物的使用

雙子葉植物受傷后傷口部位會產(chǎn)生酚類物質(zhì)如AS，這些酚類物質(zhì)對農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化具有重要作用，有研究表明加入適量的外源AS可以提高植物遺傳轉(zhuǎn)化率[25]。

AS的使用有三種方式，分別是在農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)時加入AS，在共培養(yǎng)基中加入AS和在菌液培養(yǎng)、共培養(yǎng)基中均加入AS。第一種方法使農(nóng)桿菌處于對數(shù)生長期的同時其Vir區(qū)基因也高度活化，有利于提高農(nóng)桿菌的侵染能力；第二種方法使農(nóng)桿菌侵染植物細胞時其Vir區(qū)基因處于高度活化狀態(tài)，因為農(nóng)桿菌附著在植物受傷部位后16 h后才能進行T-DNA的轉(zhuǎn)移；第三種方法兼顧前兩種方法的優(yōu)點，但也可能因AS總濃度過高而對植物生長造成不利影響。

Nakano[26]，Srinivasan等[27]分別在洋桔梗和胡蘿卜的遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入AS可以提高轉(zhuǎn)化效率。Chen[28]在藍豬耳的遺傳轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)桿菌菌液中加入AS的轉(zhuǎn)化芽誘導率顯著高于不加AS的轉(zhuǎn)化芽誘導率。

郝征在棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌菌液或是共培養(yǎng)基中添加AS都可以顯著提高冬棗葉片的遺傳轉(zhuǎn)化率。在菌液中添加AS的受體系統(tǒng)為愈傷組織再生系統(tǒng)，試驗周期較長，而在共培養(yǎng)基中添加AS后使冬棗葉片愈傷組織再生系統(tǒng)變?yōu)橹苯臃只偕到y(tǒng)，能夠使冬棗葉片直接分化出不定芽，極大縮短遺傳轉(zhuǎn)化的試驗周期[16]。Luo等[17]、郭輝力[18]在棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加60 mg/L AS可以有效促進外植體叢生芽的分化，但AS濃度過高會使外植體產(chǎn)生褐化并死亡。

2.6 預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間

外植體在轉(zhuǎn)化前是否需要預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)多長時間，對不同植物、不同外植體的研究得到的結(jié)論并不一致。黃建在棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)時間越長，獲得的初代抗性芽越多，但是多代篩選后得到的抗性芽反而越少，最終從1～5 d的預(yù)培養(yǎng)時間中選擇1 d作為最佳預(yù)培養(yǎng)時間[15]。

共培養(yǎng)是指在農(nóng)桿菌侵染外植體后外植體和農(nóng)桿菌共同生長的過程。共培養(yǎng)時間是影響植物遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素，因為農(nóng)桿菌附著在植物傷口部位16 h后才能進行T-DNA的轉(zhuǎn)移，所以共培養(yǎng)時間不能低于16 h。共培養(yǎng)時間過長則會使農(nóng)桿菌過度增殖對外植體產(chǎn)生毒害作用，一般以農(nóng)桿菌覆蓋外植體切口面為適度[20]。木本果樹的遺傳轉(zhuǎn)化大多采用1～3 d作為共培養(yǎng)時間，在已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中大部分確定共培養(yǎng)適宜時間為3～4 d[12-18]。

2.7 抑菌抗生素的選擇

共培養(yǎng)結(jié)束后要用含有抗生素的液體共培養(yǎng)基對外植體進行洗滌以除去農(nóng)桿菌，然后將外植體轉(zhuǎn)到含抗生素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，抑制殘存農(nóng)桿菌的生長直到完全脫除農(nóng)桿菌，這個過程稱為脫菌培養(yǎng)?？股夭粌H可以抑制農(nóng)桿菌生長，同時對不同植物的不同外植體也有不同的影響。為了減輕抗生素對植物的不良影響，需要對抗生素的種類和濃度進行篩選。目前，常用的抑制細菌生長的抗生素有羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)和頭孢霉素(Cefotaxime Sodium Salt，Cef)，已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究中大部分使用的是Cb[12,13,15-18]，只有孟輝的研究使用Cef[14]。

黃建在棗樹遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)，Cb可以促進葉片外植體形成愈傷組織，但高濃度Cb對愈傷組織有不利影響，而Cef對愈傷組織沒有明顯影響[15]。郝征比較頭孢曲松鈉(Ceftriaxone Sodium，CRO)和Cb的使用效果，發(fā)現(xiàn)兩種抗生素都有良好的抑菌效果，但對冬棗葉片分化出芽有抑制效果，而Cb的抑制效果較CRO更弱，因此選擇Cb作為抑菌抗生素[16]。Luo等[17]、郭輝力[18]比較Cef和Cb對壺瓶棗叢生芽分化的影響，發(fā)現(xiàn)Cb對叢生芽分化的影響優(yōu)于Cef。

2.8 選擇壓加入的時期

外植體經(jīng)過農(nóng)桿菌進行侵染和共培養(yǎng)后，并非所有植物細胞都能成功整合農(nóng)桿菌T-DNA，一般將成功整合T-DNA的植物細胞稱為轉(zhuǎn)化細胞，反之稱為非轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)化細胞中含有抗生素或除草劑的抗性基因，因此可以在選擇培養(yǎng)基中添加抗生素或除草劑對轉(zhuǎn)化細胞進行篩選，這種抗生素或除草劑對轉(zhuǎn)化細胞的選擇作用稱為選擇壓。

選擇壓加入培養(yǎng)基的時期可以分為三種：前期選擇、延遲選擇和后期選擇。前期選擇是指先進行選擇培養(yǎng)后再生為完整植株。這種方法可以較早去除非轉(zhuǎn)化細胞，減少嵌合體的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化體的純化方便，但也有植物進行前期選擇后未得到轉(zhuǎn)化植株。后期選擇是指先得到愈傷組織、不定芽或再生植株后再進行選擇培養(yǎng)，由于非轉(zhuǎn)化細胞對轉(zhuǎn)化細胞具有滋養(yǎng)作用，使用延遲選擇可以讓轉(zhuǎn)化細胞更好生長，但是產(chǎn)生的嵌合體較多，轉(zhuǎn)化體的純化困難。延遲選擇則是當愈傷組織或不定芽誘導開始時不加選擇壓，過一定時間后再加入選擇壓，這樣既能促進轉(zhuǎn)化細胞生長又能減少嵌合體產(chǎn)生，因此很多人采用延遲選擇的方法[20]。總之，不同植物的最適選擇壓加入時期也不相同。Mathews等[29]在草莓遺傳轉(zhuǎn)化的研究中發(fā)現(xiàn)逐步提高選擇壓可以明顯減少嵌合體的產(chǎn)生而保持選擇壓不變則無此效果。

在已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究中，何業(yè)華[12,13]、黃建[15]使用前期選擇，而孟輝[14]、郝征[16]、Luo等[17]、郭輝力[18]使用延遲選擇。孟輝在冬棗莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，共培養(yǎng)后延遲7 d加入抗性壓進行篩選。為了增大植物細胞與篩選劑的接觸面積，提高選擇效率，孟輝不僅在固體培養(yǎng)基中加入篩選劑，同時向莖尖滴加相同濃度的篩選劑溶液。此外，為了及時去除非轉(zhuǎn)化細胞，減少嵌合體的產(chǎn)生，孟輝在選擇培養(yǎng)的繼代過程中，使用將幼芽外植體的壞死部分切除，然后轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)的方法[14]。

2.9 AgNO3在葉片再生體系中的作用

除直接分化再生體系，黃建[16]、Luo等[17]也對棗樹葉片愈傷再生體系進行研究。褐化現(xiàn)象是愈傷組織培養(yǎng)的重要限制因素，而農(nóng)桿菌對植物的毒害作用會加重植物褐化程度，嚴重時導致外植體死亡。有研究表明，在植物遺傳轉(zhuǎn)化中，AgNO3具有抑制農(nóng)桿菌生長、抑制褐化、促進抗性芽分化、提高轉(zhuǎn)化率、減少假陽性轉(zhuǎn)化體的作用[30]。在棗樹葉片愈傷再生體系的研究中，黃建和Luo等均使用5 mg/L的AgNO3，取得較好的促進愈傷分化和減輕褐化的效果。

3 轉(zhuǎn)基因植物的鑒定

為了確定外源基因是否進入植物細胞，進入植物細胞的外源基因是否整合到植物染色體上，整合的方式如何，整合到染色體上的外源基因是否表達等一系列問題，有必要對轉(zhuǎn)基因植物進行檢測鑒定。

目前已經(jīng)發(fā)展出一系列的轉(zhuǎn)基因植物的檢測和鑒定方法。根據(jù)檢測的基因功能分為調(diào)控基因(啟動子和終止子)檢測、選擇標記基因檢測和目的基因直接檢測。根據(jù)檢測的不同階段分為整合水平檢測和表達水平檢測。外源基因整合檢測有Southern雜交、PCR、PCR-Southern雜交、原位雜交和DNA分子標記技術(shù)等；表達水平的檢測有Northern雜交、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、酶聯(lián)免疫吸收法(ELISA)和Western雜交等[21]。

已報道的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究一般使用PCR的方法初步驗證遺傳轉(zhuǎn)化是否成功。在此基礎(chǔ)上，何業(yè)華對7株P(guān)CR陽性轉(zhuǎn)化植株使用Southern雜交分析，證明其中6株的ACC反義基因成功整合到棗樹染色體上。進一步使用Real-time PCR對6株Southern雜交陽性植株和1株Southern雜交陰性植株的基因表達進行分析發(fā)現(xiàn)，陽性植株中含有ACC合成酶反義基因RNA而陰性植株中未檢測到，證明ACC反義基因在轉(zhuǎn)錄水平得到表達[13]。Luo等通過熒光實時定量技術(shù)比較3個不同轉(zhuǎn)化植株中表達效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)株系2是其他兩個株系的1.16倍；通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)分析確定轉(zhuǎn)基因壺瓶棗樣品中存在白藜蘆醇，其鮮重含量為0.45 μg/g[17]。郭輝力通過PCR-Southern雜交和Northern雜交證明4CL-STS融合基因已整合到壺瓶棗基因組DNA中，且得到轉(zhuǎn)錄水平表達。進一步通過HPLC-MS分析確定轉(zhuǎn)基因壺瓶棗樣品中存在白藜蘆醇，其鮮重含量為2.07 μg/g，是轉(zhuǎn)STS單基因棗樹的4.6倍[18]。

4 轉(zhuǎn)基因植物的功能驗證

外源基因轉(zhuǎn)入植物后，能否發(fā)揮預(yù)期的功能是遺傳轉(zhuǎn)化是否成功的重要標志。目前僅有Luo等、郭輝力進行轉(zhuǎn)基因棗樹材料功能方面的驗證。Luo等研究發(fā)現(xiàn)，相對野生型材料，轉(zhuǎn)入STS基因的植物材料中葉片、莖干和莖尖等100 μL提取液對桃褐腐真菌(Moniliniafrvcticola)抑菌率分別為25.0%、28.57%和16.07%，抑菌效果相當于1 μg白黎蘆醇樣品(抑菌率為23.08%)，同時對棗常見真菌病原菌抑菌效果顯著，此外發(fā)現(xiàn)螨(Tetranychuscinnabarinus)對轉(zhuǎn)基因遺傳材料有趨避的現(xiàn)象[17]。郭輝力發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)4CL-STS融合基因的植株對棗樹常見真菌病原菌有明顯的抑制作用[18]。

5 存在的問題及展望

棗樹是中國第一大干果樹種，具有重要的經(jīng)濟價值和生態(tài)價值。近年來基因工程技術(shù)在棗樹研究中得到廣泛的應(yīng)用，取得一些重要進展，但與其他果樹和農(nóng)作物相比，棗樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究仍然處于起步階段，還存在不少問題，具體表現(xiàn)在：

受體系統(tǒng)不易建立。棗樹作為木本植物，組培困難，且存在愈傷組織分化率低的問題，所以大部分研究使用外植體直接分化體系。

轉(zhuǎn)化率偏低。由于棗樹是木本植物，遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，且大部分研究使用外植體直接分化再生體系，導致棗樹轉(zhuǎn)化率偏低。

嵌合體嚴重。無論是愈傷再生體系還是直接分化再生體系，都存在嵌合體多的問題，給后續(xù)的篩選造成困難。

功能基因的遺傳轉(zhuǎn)化未得到實踐檢驗。目前大部分研究只得到轉(zhuǎn)基因植株，但是沒有對轉(zhuǎn)基因植株進行具體的生理生化測定試驗和嫁接試驗，因此無法評定其在生產(chǎn)實踐中的具體效果。

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)不斷發(fā)展，未來可以進行棗重要性狀基因的定位與克隆，建立和優(yōu)化受體系統(tǒng)，優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化條件，優(yōu)化篩選方法等，提高棗樹遺傳轉(zhuǎn)化率，加快棗樹的定向育種，有望培育出抗性強、口感好、營養(yǎng)高、具有保健品質(zhì)的優(yōu)良品種。