Ｃｅｐ１６４基因缺失對(duì)小鼠胚胎早期腦發(fā)育的影響

摘要：利用Foxg1、Gbx2、Otx2、Fgf8和En1探針與小鼠胚胎進(jìn)行原位雜交，分析Foxg1、Gbx2、Otx2、Fgf8和En1基因在Cep164基因缺失小鼠胚胎腦中的表達(dá)情況，確定Cep164基因?qū)δX發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，與野生型相比，Cep164基因突變小鼠胚胎頭部Gbx2、前中腦Otx2和中后腦的邊界Fgf8表達(dá)無明顯變化，但端腦泡Foxg1表達(dá)減少，前神經(jīng)脊Fgf8表達(dá)減少，Otx2在晶狀體板和嗅狀體板表達(dá)減少，背側(cè)中腦和后腦前En1表達(dá)減少。這說明Cep164基因是維持胚胎頭部正常發(fā)育的重要基因，Cep164基因突變會(huì)導(dǎo)致前腦發(fā)育異常，主要影響嗅覺和視覺功能。

關(guān)鍵詞：Cep164;基因缺失;小鼠胚胎;腦發(fā)育;原位雜交

中圖分類號(hào)：S852.2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）23-0139-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.23.033? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Effects of Cep164 gene deletion on embryonic mouse brain development

WANG Chun-hua

（School of Life Science and Technology，Mudajiang Normal University，Mudanjiang 157000，Heilongjiang，China）

Abstract： To reveal the function of Cep164 gene in mouse brain development， the expression level of Foxg1，Otx2，Gbx2，F(xiàn)gf8 and En1 in embryonic brain with Cep164 gene deletion was detected by in situ hybridization experiment. The results showed that the expression of Gbx2 and Otx2 in the brain， and Fgf8 in the midbrain-hindbrain boundary， were no significant change in the Cep164 mutation embryonic mice， compared with wild type. But the expression of Foxg1 in telencephalic vesicles， the Fgf8 in anterior neural ridge， the Otx2 in eye and olfaction plate， and En1 in ventral midbrain and anterior hindbrain decreased. The all results reveal Cep164 is an important gene to maintain the normal brain development. Cep164 gene mutation could cause forebrain dysplasia， mainly affect olfaction and vision.

Key words： Cep164; gene deletion; embryonic mouse; brain development; in situ hybridization

Cep164是中心體激活元件Cep家族的一員，位于母中心粒基體末端，參與纖毛的形成過程[1]。研究人員通過siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞中Cep164基因，證明當(dāng)Cep164基因突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中纖毛缺失[2]。Moumita等[3]在對(duì)纖毛相關(guān)腎消耗病患者的基因分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，患者的Cep164基因發(fā)生純合子點(diǎn)突變。通過斑馬魚試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cep164基因突變時(shí)斑馬魚發(fā)生腎消耗?。∟ephronophthisis-related ciliopathies，NPHP-RC），表型包括腎小管囊腫、腦積水和視網(wǎng)膜發(fā)育不良[3]。但關(guān)于哺乳動(dòng)物的突變表型并未見相關(guān)報(bào)道。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Cep164基因突變會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，表型包括胚胎發(fā)育遲緩、心臟外膜增大擴(kuò)張、血管發(fā)育不良、背側(cè)神經(jīng)管不對(duì)稱發(fā)育、胚胎軀體異常彎曲、面部前脊神經(jīng)管不閉合、頭部神經(jīng)管閉合不全、心臟反向扭轉(zhuǎn)彎曲[4]。由于Cep164基因突變導(dǎo)致胚胎存活不到14.5 d，腦發(fā)育的表型并未觀察到。本研究利用原位雜交技術(shù)對(duì)小鼠胚胎腦部發(fā)育中特異性基因En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2的表達(dá)與分布進(jìn)行檢測(cè)，一方面利用基因在胚胎腦發(fā)育過程中特定位置來確定Cep164基因?qū)δX發(fā)育的影響，另一方面推測(cè)Cep164基因?qū)δX發(fā)育的影響機(jī)制。

1? 材料與方法

1.1? 材料

Cep164基因敲除雜合子小鼠（Cep164+/-）饋贈(zèng)于美國康奈爾大學(xué)。Cep164基因敲除雜合子雌鼠（Cep164+/-）與Cep164+/-雄鼠進(jìn)行雜交，以合籠次日雌鼠見陰栓記為懷孕0.5 d（E0.5），在E10.5采用頸椎脫臼法處死懷孕母鼠，根據(jù)基因型檢驗(yàn)獲得E 9.5的Cep164-/-與野生型（WT）胎鼠。

1.2? 探針準(zhǔn)備

參照Graser等[1]的方法合成 En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2基因探針。采用5組引物（表1），選用巢式PCR分別擴(kuò)增目標(biāo)基因，純化PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切，連接PBS-SK質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞挑取單克隆，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序確認(rèn)序列無誤及判斷插入方向后，采用BamH Ⅰ將Bs-En1、Bs-Otx2、Bs-Fgf8和Bs-Foxg1重組質(zhì)粒線性化，EcoR Ⅰ將Bs-Gbx2重組質(zhì)粒線性化。如圖1所示，以線性化片段為模版用T3或T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成帶地高辛（DIG）標(biāo)記的En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2基因探針。分別取1 μL反應(yīng)物，用葡聚糖凝膠電泳進(jìn)行探針檢測(cè)。

1.3? 原位雜交

將E10.5胚胎用4%多聚甲醛固定后在4 ℃條件下過夜，經(jīng)甲醇梯度脫水，復(fù)水后，0.2%戊二醛再固定胚胎，參考Martinez-Barbera等[5]的方法，用En1、Otx2、Fgf8、Foxg1和Gbx2探針進(jìn)行胚胎頭部的原位雜交。

2? 結(jié)果與分析

2.1? En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2原位雜交探針

如圖2所示，1 μL反應(yīng)物的葡聚糖凝膠電泳結(jié)果顯示，En1、Otx2、Foxg1、Fgf8和Gbx2的條帶位置均與擴(kuò)增目標(biāo)條帶位置相同，分別為1 040、1 000、820、820、820 bp，并且反應(yīng)效率高，濃度足夠作為探針與胚胎進(jìn)行原位雜交。

2.2? Cep164-/-胚胎前腦發(fā)育異常

正常胚胎頭部發(fā)育中，F(xiàn)oxg1表達(dá)在端腦泡（Telencephalic vesicle），如圖3A所示。與其相比，圖3a中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部Foxg1的表達(dá)范圍減少，說明Cep164突變導(dǎo)致小鼠胚胎端腦泡體積減小。

正常胚胎頭部發(fā)育中，Gbx2表達(dá)在中后腦邊界區(qū)域（Mid-hind brian boundary，MHB），如圖3B所示。與其相比，圖3b中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部Gbx2的表達(dá)不變。

正常胚胎頭部發(fā)育中，Otx2表達(dá)在晶狀體板、嗅基板、前腦中腦區(qū)域，如圖3C所示。與其相比，圖3c中，Cep164-/-小鼠胚胎Otx2在晶狀體板和嗅基板減少，在前腦中腦區(qū)域表達(dá)正常。

正常胚胎頭部發(fā)育中，En1表達(dá)在背側(cè)中腦和后腦前，如圖3D所示。與其相比，圖3d中，Cep164-/-小鼠胚胎背側(cè)中腦和后腦前En1表達(dá)減少。

正常胚胎頭部發(fā)育中，F(xiàn)gf8表達(dá)在中后腦邊界區(qū)域和前神經(jīng)脊（Anterior neural ridge，ANR），如圖3E和圖3F所示。與圖3E相比，圖3e中，Cep164-/-小鼠胚胎頭部中后腦邊界區(qū)域表達(dá)范圍無明顯變化。與圖3F相比，圖3f中，Cep164-/-小鼠胚胎前神經(jīng)脊表達(dá)范圍明顯減少。

3? 討論

在脊椎動(dòng)物中，中腦和后腦邊界提供了中腦和后腦喙部模式形成的基本組織信號(hào)。通過Otx2和Gbx2基因的表達(dá)可確定MHB最終位置，Otx2和Gbx2基因可激活MHB特異性基因Fgf8，Otx2或Gbx2基因的缺失不能抑制MHB的形成，但能改變MHB位置和Fgf8的表達(dá)區(qū)域，Otx2基因缺失可導(dǎo)致MHB向喙部移動(dòng)，而Gbx2基因缺失導(dǎo)致MHB向尾部移動(dòng)，當(dāng)小鼠Otx2和Gbx2基因同時(shí)失活，F(xiàn)gf8的表達(dá)完全正常，但表達(dá)區(qū)域變大，說明Fgf8的表達(dá)不依賴于這兩個(gè)基因[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cep164基因突變對(duì)胚胎頭部發(fā)育中Gbx2表達(dá)在MHB和Otx2在前腦、中腦區(qū)域表達(dá)正常，F(xiàn)gf8在頭部中后腦邊界區(qū)域表達(dá)范圍也無明顯變化，說明Cep164對(duì)MHB的形成位置和面積均無影響。

Oxt2在鼠胚胎發(fā)育過程中，除了在前腦、間腦的神經(jīng)外胚層表達(dá)外，還在晶狀體板表達(dá)[6]，與Pax6.0共同調(diào)節(jié)控制視網(wǎng)膜上皮色素細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及再生視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化[7]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cep164基因突變導(dǎo)致晶狀體板和嗅基板Otx2表達(dá)減少，說明Cep164基因的缺失影響了視覺和嗅覺正常功能的發(fā)育，Cep164基因突變可能會(huì)導(dǎo)致小鼠視覺和嗅覺功能障礙，這也是纖毛病變的表型之一。Fgf8是前腦發(fā)育過程中至關(guān)重要的信號(hào)分子[8，9]，除了表達(dá)在中后腦邊界區(qū)域，還在前神經(jīng)脊表達(dá)，試驗(yàn)結(jié)果顯示Cep164突變小鼠前神經(jīng)脊Fgf8表達(dá)范圍明顯減少，Cep164基因突變小鼠的前腦小于野生型胚胎，這可能是Cep164基因突變導(dǎo)致小鼠胚胎前腦發(fā)育異常的原因之一。特異性表達(dá)在端腦泡的Foxg1基因?qū)η澳X正常發(fā)育也至關(guān)重要，F(xiàn)oxg1在Cep164基因突變小鼠胚胎中表達(dá)減少，端腦泡體積減小，此結(jié)果與Fgf8結(jié)論一致，進(jìn)一步說明Cep164基因與胚胎前腦正常發(fā)育相關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] GRASER S，STIERHOF Y D，LAVOIE S B，et al. Cep164， a novel centriole appendage protein required for primary cilium formation[J].J Cell Biol，2007，179（2）：321-330.

[2] SCHMIDT K N，KUHNS S，NEUNER A，et al. Cep164 mediates vesicular docking to the mother centriole during early steps of ciliogenesis[J].J Cell Biol，2012，199（7）：1083-1101.

[3] MOUMITA C，RANNAR A，AMIYA K，et al. Exome capture reveals ZNF423 and CEP164 mutations，linking renal ciliopathies to DNA and damage response signaling[J].Cell，2012，150（3）：533-548.

[4] 王春花.Cep164基因在小鼠胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過程中的功能及作用[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[5] MARTINEZ-BARBERA J P，SIGNORE M，BOYL P P，et al. Regionalisation of anterior neuroectoderm and its competence in responding to forebrain and midbrain inducing activities depend on mutual antagonism between OTX2 and GBX2[J].Development，2001，128（23）：4789-4800.

[6] CVEKL A，PIATIGORSKY J. Lens development and crystalline gene expression：Many roles for Pax6[J].BioEssays，1996，18（8）：621-630.

[7] AVDONIN P P，MARKITANTOVA Y V，ZINOVIEVA R D，et al.? Expression of regulatory genes Pax6，Otx2，Six3，and FGF2 during newt retina regeneration[J].Biology bulletin，2008，35（4）：355-361.

[8] MEYERS E N，LEWANDOSKI M，MARTIN G R. An Fgf8 mutant allelic series generated by Cre-and Flp-mediated recombination[J].Nat Genet，1998，18（2）：136-141.

[9] SHIMAMURA K，RUBENSTEIN J L. Inductive interactions direct early regionalization of the mouse forebrain[J].Development，1997， 124：2709-2718.