• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    以子房為材料制備煙草染色體標(biāo)本的方法

    2019-09-10 07:22:44楊垚張艷黨江波梁國魯郭啟高龐靜
    中國煙草科學(xué) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:原位雜交煙草

    楊垚 張艷 黨江波 梁國魯 郭啟高 龐靜

    摘 ?要:為使煙草染色體標(biāo)本制備過程中取材更方便,本研究以異源五倍體煙草(2n=5x=58)為材料,觀察了不同大小子房、不同預(yù)處理方法對(duì)煙草染色體制片效果的影響。首先,子房大小按花冠與花萼長(zhǎng)度比例分為6類;其次,預(yù)處理方法分為2類,即:(1)室溫下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預(yù)處理2、4和6 h;(2)7 ℃下于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中預(yù)處理12、24和36 h。結(jié)果顯示,當(dāng)花冠長(zhǎng)度小于或等于花萼長(zhǎng)度的1/2時(shí),子房中分裂期細(xì)胞的比例最大,為97.00±17.82個(gè)/1000個(gè)。該時(shí)期子房于7 ℃經(jīng)24 h預(yù)處理后,染色體數(shù)目與形態(tài)清晰可辨。利用上述方法制作云煙87(2n=4x=48)和(2n=2x=20)的染色體標(biāo)本,均獲得較好的結(jié)果。此外,將上述方法制作的五倍體煙草染色體經(jīng)5S rDNA-FISH,獲得了清晰可辨的5個(gè)不同信號(hào),與預(yù)期一致??梢?,幼嫩子房可用于煙草染色體標(biāo)本的制作,且用改良的預(yù)處理方法制備的染色體標(biāo)本可用于染色體計(jì)數(shù)和核型分析,也可用于原位雜交分析。

    關(guān)鍵詞:煙草;幼嫩子房;染色體制片;原位雜交

    中圖分類號(hào):S572.03 ?????????文章編號(hào):1007-5119(2019)04-0056-06 ?????DOI:10.13496/j.issn.1007-5119.2019.04.009

    Study on ?Chromosome Specimen?Preparation Using Ovary

    YANG Yao, ZHANG Yan, DANG Jiangbo, LIANG Guolu, GUO Qigao, PANG Jing

    (1. College of Horticulture and Landscape, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Tobacco Research Institute, Chongqing Municipal Tobacco Company, Chongqing 400715, China; 3. Zunyi Tobacco Company of Guizhou Province, Meitan Branch, Zunyi, Guizhou 564100, China)

    ?In order to obtain materials of ?plants easily when preparing chromosome?specimens, in this study, allopentaploid tobacco (2n=5x=58) was used as materials to observe?the effects of ovary?sizes and pretreatment methods on ?plants chromosome specimen preparation. First, ovaries were divided?into?6 types based on corolla length/calyx length; and then, two pretreatments were compared, one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at normal atmospheric temperature for 2, 4?and 6 h, the other one was pretreatment in 0.002 mol/L 8-hydroxy-quinoline solution at 7 ℃?for 12, 24 and 36 h. When the length of the corolla was less than or equal to 1/2 of the calyx, the ratio of mitotic cells reached the highest, being?97.00±17.82 in 1000 cells. When ovaries with the most mitotic cells were pretreated at 7 ℃?for 24 h, the number and configuration of chromosomes were clear and distinguishable. The above mentioned?methods?were?applied in chromosome specimen preparation of Yunyan87 (2n=4x=48) and ?(2n=2x=20), and nice results were obtained, respectively. In addition, 5S rDNA-FISH?was carried out on chromosomes of ,?and?expected recognizable signals were found on 5 different chromosomes. These results indicated that tender?ovary could be used to prepare chromosome specimens of ?plants. Chromosome?specimens prepared with modified method were not only beneficial to chromosomes counting?and karyotype analysis, but also can be applied to in situ hybridization analysis.

    ?; tender ovary; chromosome specimen preparation; in situ hybridization

    染色體是基因的載體,其數(shù)目和形態(tài)是生物的主要特征。根據(jù)染色體的數(shù)目和形態(tài),可對(duì)生物的進(jìn)化和分類進(jìn)行研究。在生物育種中也常涉及對(duì)染色體數(shù)目、形態(tài)的觀察。染色體標(biāo)本制作是染色體觀察和研究的基礎(chǔ),對(duì)生物研究和育種均較為重要。染色體標(biāo)本制作時(shí)需選取生長(zhǎng)旺盛的組織為

    材料,如幼嫩根尖、幼嫩莖尖以及幼嫩葉片等,其中,種子萌發(fā)的根尖較為常用。

    煙草為茄科(Solanaceae)煙草屬()植物的通稱,煙草染色體制片主要以種子萌發(fā)的根尖和幼苗的根尖為材料。然而對(duì)于煙草屬植物,無論是種子萌發(fā)的根尖還是幼苗的根尖均較為細(xì)小,取材難度較大,后續(xù)處理過程中材料較易丟失,且切取根尖易對(duì)植株造成傷害,在單株材料的染色體分析中不宜應(yīng)用。幼嫩花蕾(子房)在部分植物中被用于染色體標(biāo)本的制備,而未見在煙草中應(yīng)用。煙草花量較多,花期較長(zhǎng),取材方便,且取花蕾對(duì)植株的傷害較小,也不影響后續(xù)的結(jié)實(shí)以及雜交等環(huán)節(jié),這有利于數(shù)量較少且較為珍貴的材料的染色體制備。

    本研究以煙草屬異源五倍體植株為材料,對(duì)利用花蕾(子房)進(jìn)行煙草染色體制片的可行性進(jìn)行分析,為煙草染色體標(biāo)本的制作提供參考。

    1 ?材料與方法

    1.1 ?試驗(yàn)材料

    煙草四倍體材料云煙87(2n=4x=48)、煙草二倍體材料(2n=2x=20)由國家煙草種質(zhì)資源中期庫提供。煙草異源五倍體(2n=5x=58)材料是以云煙87八倍體(2n=8x=96)為母本與為父本雜交,經(jīng)組織培養(yǎng)繁育獲得。所有材料均種植于西南大學(xué)園藝園林學(xué)院試驗(yàn)基地。

    1.2 ?方法

    1.2.1??不同大小子房中分裂期細(xì)胞的比例觀察?根據(jù)前期的觀察與測(cè)量,按花冠與花萼長(zhǎng)度的比例將異源五倍體煙草的子房分為6類(表1)。于晴天在上午9:00—11:00取下6種不同類型的花蕾,自花托和子房連接處用鋒利刀片分割,將子房去花柱后置于卡諾固定液(∶=1∶3)中固定過夜。取出后用蒸餾水清洗2次,并于第3次清洗過程中浸泡約20 min以去除固定液。后將子房分割為約1 mm的組織塊,放入混合酶液(3%纖維素酶+0.3%果膠酶)中于37 ℃下孵育1.5 h。蒸餾水輕柔清洗2次以去除酶液,加卡諾固定液固定。采用壓片法觀察,記錄處于分裂期的細(xì)胞數(shù)量和觀察細(xì)胞總數(shù)量,計(jì)算分裂期細(xì)胞的比例。每類花蕾5個(gè)重復(fù)。

    1.2.2??不同方法預(yù)處理及染色體制備??取有絲分裂細(xì)胞占比最大的異源五倍體花蕾類型,按前述方法分割后取子房浸沒于0.002 mol/L的8-羥基喹啉中,按以下2類方法進(jìn)行預(yù)處理:

    (1)在室溫(約25 ℃)條件下分別處理2、4和6 h。

    (2)在7 ℃條件下分別處理12、24和36 h。

    預(yù)處理后用卡諾固定液固定過夜,再按前述方法酶解,以涂片法進(jìn)行制片,火焰干燥,5%吉姆薩染色。各處理5個(gè)重復(fù),經(jīng)鏡檢統(tǒng)計(jì)中期分裂相細(xì)胞的比例,觀察染色體形態(tài),并以此對(duì)不同預(yù)處理方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    云煙87和的子房按最佳方法進(jìn)行預(yù)處理。

    1.2.3??5S rDNA原位雜交??(1)5S rDNA探針制備:供試探針自擬南芥5S rDNA序列中選取,由上海生工生物工程公司合成,并利用TAMRA(四甲基羅丹明)對(duì)其5'端進(jìn)行修飾。(2)原位雜交方法:參照陳志的方法進(jìn)行,依次是染色體標(biāo)本的預(yù)處理與固定、探針和染色體的變性、雜交、雜交后洗脫、信號(hào)檢測(cè)與圖像處理。其中不同的是:雜交過程中探針終濃度為2?ng/μL,直接以2×SSC溶液配制,不經(jīng)變性直接進(jìn)行雜交,雜交時(shí)間為2?h;雜交后直接用2×SSC在常溫下洗脫2次。

    2 ?結(jié)??果

    2.1 ?不同大小子房中分裂期細(xì)胞數(shù)量

    不同大小子房中處于分裂期的細(xì)胞比例見表2。由表2中可見,第2類子房即花冠長(zhǎng)度小于等于花萼長(zhǎng)度的1/2的子房中分裂期細(xì)胞占比最大,每1000個(gè)細(xì)胞中有97.00±17.82個(gè)(圖1),與其他類型子房中的比例相比差異顯著或極顯著;其次是第3類和第4類子房。但第3類與第4類子房相比差異不顯著??梢?,第2類子房最適于染色體標(biāo)本制備。

    2.2 ?不同方法預(yù)處理子房制片效果

    表3所示,同一方法在不同溫度下,隨著預(yù)處理時(shí)間的增加,制片中中期分裂相的細(xì)胞數(shù)目均增加,最長(zhǎng)染色體的長(zhǎng)度縮短,染色體的縊痕逐漸明顯,著絲點(diǎn)顯現(xiàn)出來。

    室溫條件下,異源五倍體煙草經(jīng)2 h預(yù)處理,最長(zhǎng)染色體的長(zhǎng)度為10.30~15.24 μm,大部分染色體邊緣模糊,著絲點(diǎn)未見,著色較淺。經(jīng)4 h(圖2B)、6 h預(yù)處理,雖部分染色體著絲點(diǎn)顯現(xiàn),但邊緣較模糊,形態(tài)仍較難清晰分辨。在7 ℃下,經(jīng)12 h預(yù)處理,大部分染色體著絲點(diǎn)已經(jīng)顯現(xiàn),邊緣較清晰,但長(zhǎng)度稍長(zhǎng);24 h預(yù)處理(圖2A),所有染色體著絲點(diǎn)清晰可見,邊緣清晰,長(zhǎng)度適中,且分散性較好。在處理36 h后,大部分可見染色單體,但染色體長(zhǎng)度較短,過度凝縮,亦不利于形態(tài)識(shí)別和測(cè)量。

    2.3 ?云煙87和制片

    以子房為材料,經(jīng)7 ℃預(yù)處理24 h后對(duì)云煙87和進(jìn)行染色體制片。從制片結(jié)果中可以看出,兩種煙草的染色體均較分散,形態(tài)舒展,邊緣清晰,可用于計(jì)數(shù)和核型分析(圖3)。

    圖3 ?以子房為材料及用改良的預(yù)處理方法制得的云煙87(A)和(B)的染色體

    Fig. 3 ?Chromosomes of Yunyan87 and ?using ovaries as materials pretreated for 24 h at 7 ℃

    2.4 ?異源五倍體煙草5S rDNA原位雜交效果

    將最佳方法制備的異源五倍體煙草染色體標(biāo)本用于5S rDNA原位雜交。圖4結(jié)果顯示,雜交信號(hào)亮度較明顯,易于識(shí)別。該中期染色體上共有5個(gè)5S rDNA雜交信號(hào),與預(yù)期相符合。說明采用上述最佳方法所制的異源五倍體煙草染色體標(biāo)本可用于原位雜交。

    3 ?討??論

    花蕾由莖尖分生組織分化發(fā)育而來,幼嫩花蕾快速生長(zhǎng)、膨大,這是幼嫩花蕾可用于進(jìn)行染色體制片的主要原因。不同時(shí)期處于分裂期的細(xì)胞比例不同,說明不同時(shí)期花蕾的生長(zhǎng)速度不同。染色體制片過程中,常采用單一方法進(jìn)行預(yù)處理,其中秋水仙素和8-羥基喹啉較為常用,低溫誘導(dǎo)也有見報(bào)道。低溫處理可間接地對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用,這樣有助于后期觀察染色體的形態(tài)。本研究采用化學(xué)試劑結(jié)合低溫誘導(dǎo),效果較單一化學(xué)試劑處理較好。且低溫處理的染色體長(zhǎng)度分布范圍較常溫處理的小,表明低溫處理使染色體長(zhǎng)度較均一。這可能是低溫使整個(gè)花蕾在短時(shí)間處于同一條件,還延緩了花蕾的生長(zhǎng)活動(dòng),使8-羥基喹啉更充分地滲入所有細(xì)胞,以使更多細(xì)胞所處條件更趨于一致。

    原位雜交在煙草遠(yuǎn)緣雜交育種以及煙草屬植物的進(jìn)化、分類中有較多應(yīng)用。原位雜交要求分裂相背景較少,染色體形態(tài)舒展。在本研究中,以20 bp的5S rDNA保守序列為探針,進(jìn)行雜交,雜交后的分裂相背景淺,染色體形態(tài)清晰可辨,所獲得的信號(hào)也較強(qiáng),且數(shù)量與預(yù)期一致。這說明,這種方法獲得的染色體適于原位雜交,對(duì)較短的探針序列也較為實(shí)用,且效果良好。這為后續(xù)煙草屬植物細(xì)胞遺傳學(xué)分析過程中的染色體制備提供了較好的方法。

    煙草育種特別是遠(yuǎn)緣雜交育種過程中常涉及重要單株材料的染色體鑒定和分析。這類分析過程中,往往面臨材料較少的問題,且這類分析對(duì)制片的效果要求也較高。本研究所得結(jié)果為這類材料的?單株染色體制備提供了較好的方法。該方法在云煙87和N. plumbaginifolia及二者的雜種(異源五倍體)?材料中均有較好效果,表明這種方法有較為廣泛?的應(yīng)用范圍。較多野生煙草的子房較小,如本研究 中所用的,處于最佳時(shí)期的子房的長(zhǎng)度僅1~2 mm。這增加了部分處理過程的難度。為了取材和處理方便,在預(yù)處理時(shí)可將包含多個(gè)花蕾的花序一起放入預(yù)處理液中處理。

    但是,以花蕾為材料制備染色體標(biāo)本,不能對(duì)材料進(jìn)行早期鑒定。一方面周期較長(zhǎng),另一方面對(duì)場(chǎng)地面積有較多要求。故本方法并不太適于大規(guī)模篩選、鑒定以及對(duì)純系材料的早期鑒定。大規(guī)模篩選、鑒定可結(jié)合其他方法如流式細(xì)胞術(shù)、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞觀察等進(jìn)行初選,再用本研究所得方法進(jìn)行后期鑒定。

    綜上所述,本研究的最佳方法適于煙草染色體標(biāo)本的制作,且制片可用于分子細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中,這為煙草的細(xì)胞遺傳學(xué)分析提供參考。

    參考文獻(xiàn)

    YAO S H. History and current status of research on relationship between chromosomal evolution and biological evolution[J]. Journal of Guizhou Normal University(Natural Sciences), 1993(4): 75-83.

    LI M X. Plant chromosomal size variation and evolution[J]. Bulletin of Biology, 1985(5): 14-16.

    JIA?F X, ZHOU?M B, CHEN?R, et al. Karyotype and genome size in four bamboo species[J]. Scientia Silvae Sinicae, 2016, 52(9): 57-66.

    SHAO B J, WAN S Q, LIU J M, et al. Polyploidy induction and identification of?and [J].?Molecular Plant Breeding,?2018, 16(8): 2593-2599.

    DAI X M, HUANG Q C, JIA H R, et al. The identification methods of ploidy in rice polyploidy breeding[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2008(4): 94-96.

    WEN X M, ZHANG N, YUE Y, et al. Summary of results and influencing factors of grape polyploidy breeding[J]. Sino-Overseas Grapevine & Wine, 2017(4): 95-99.

    • 杜培,張新友,李麗娜,等. 高質(zhì)量花生根尖細(xì)胞染色體制片方法研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,42(3):31-35.

    DU P, ZHANG X Y, LI L N, et al.?Study on slide preparation methods for high quality chromosomes from root tip cells of [J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2013, 42(3): 31-35.

    LI X L, YANG J, WANG H T, et al.?Optimization of chromosome mounting technique and karyotype analysis of tree [J]. Journal of Henan Agricultural Sciences, 2009(7): 102-106.

    GAO J H, XING S Y, JIANG Y Z, et al.?Chromosome karyotype analysis ginkgo ornamental cultivars[J]. Journal of Shandong Agricultural University(Natural?Science Edition), 2005(1): 19-24.

    • KENTON A, PAROKONNY A S, GLEBA Y Y, et al. Characterization of the ?L.?genome by molecular cytogenetics[J]. Molecular?&?General Genetics Mgg, 1993, 240(2):?159-169.
    • LIM K Y, ROMAN M, LICHTENSTEIN C P, et al. Molecular cytogenetic analyses and phylogenetic studies in the??section tomentosae[J]. Chromosoma, 2000, 109(4):?245-258.
    • NAKAMURA R,?KITAMURA S, INOUE M,?et al. Karyotype analysis of ?Y.?Ohashi using DAPI banding and rDNA FISH[J]. Theoretical and Applied Genetics,?2001,?102(6-7):?810-814.
    • 王霖嬌,任學(xué)良,盛茂銀,等. 具翼煙草()核型、C帶與rDNA染色體定位研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2017,23(1):95-101.

    WANG L J, REN X L, SHENG M Y, et al. Study on karyotype, C-banding and rDNA chromosome locus in[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1): 95-101.

    ZHOU X H, GUI M, XIA J, et al.?Studies on identifying number of chromosome in carnation by using ovary wall[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2010, 22(1): 61-63.

    • 涂偉鳳,張洋,湯潔,等. 印度蔊菜()有絲分裂進(jìn)程觀察與核型分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018,30(11):6-9.

    TU W F, ZHANG Y, TANG J, et al. Mitosis process observation and karyotype analysis of [J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2018, 30(11): 6-9.

    ZHANG H M. Cytogenetical studies of broccoli and other brassica crops[D]. Nanjing:?Nanjing Agricultural University, 2009.

    XU C Y, WANG L P, WANG J J. Observation of the chromosome in the somatic cell of natural tetraploid ?makino[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(28): 15503-15509.

    • 黨江波,趙申清玉,鄧紅紅,等.?Lin.-?Viv.雜種的鑒定及其育性和黑脛病抗性的初步分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2016,22(2):93-99.

    DANG J?B, ZHAO S?Q Y,?DENG H?H,?et al.?Identification of ??Lin. and ??Viv. hybrid and primary analysis of its fertility and resistance to black shank disease[J].?Acta Tabacaria Sinica,?2016,?22(2):?93-99.

    DING H, QIU D P, CHEN S X. Research progress in plant chromosome samples preparation and karyotype analysis[J]. Journal of Southern Agriculture, 2012, 43(12): 1958-1962.

    ZHAO Q, CHEN Z, YANG X, et al. Chromosome localization of 5S rDNA of natural tetraploids and their corresponding diploids in?by fluorescence ?hybridizatio[J]. Journal of Southwest University(Natural Science Edition), 2016, 38(11): 34-39.

    CHEN Z. FISH analysis of 5S rDNA in?and close related genera[D]. Chongqing: Southwest University, 2015.

    DONG X M, DING K Y, WANG H C, et al. Karyotype of ?(Boraginaceae), a species endemic to China[J]. Guihaia, 2011, 31(4): 441-443.

    NI Y Y, YANG W J, LIU J F, et al. Karyomorphology of five?species[J]. Forest Research, 2017, 30(2): 189-193.

    REN W J, GUO X F, JIANG L N, et al. Optimization of chromosome mounting technique and karyotype analysis of culinary rhubarb[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica, 2013, 28(5): 128-132.

    CHEN S Y, FANG C, SUN Y, et al.?Study on optimization of observing method for chromosome of root-tip tissue in [J]. Grassland and Turf, 2008(2): 23-26.

    ZOU J W, GUO Z Q, ZHANG Z W, et al. Influences of different factors on chromosome preparation of root-tip tissue in wheat[J]. Seed, 2016, 35(12): 8-11.

    SHI L R, WANG J, CUI X G. Study on karyotype analysis methods of [J]. Northern Horticulture, 2009(2): 53-55.

    LI Q Y, WANG S S, ZHOU P L, et al. Effects of low temperature stress on leaf shape and physiological characteristics in tobacco seedlings[J]. Chinese Tobacco Science, 2018, 39(1): 17-23.

    ZHAI N, XU Y L, LIU P P, et al. Applications of flow cytometry in plant and tobacco research[J]. Tobacco Science & Technology, 2018, 51(9): 98-104.

    ZHU H Q, ZHANG X Y, XUE Q Z. Rapid determination of ploidy level of chromosome in tobacco()[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2006(2): 255-258.

    猜你喜歡
    原位雜交煙草
    煙草具有輻射性?
    水稻整體原位雜交實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的改進(jìn)
    煙草依賴的診斷標(biāo)準(zhǔn)
    熒光原位雜交衍生技術(shù)及其在藥用植物遺傳學(xué)中的應(yīng)用
    煙草中茄酮的富集和應(yīng)用
    EBER顯色原位雜交技術(shù)在口腔頜面部淋巴上皮癌中的應(yīng)用體會(huì)
    染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)用于產(chǎn)前診斷的價(jià)值
    臨床實(shí)驗(yàn)室熒光原位雜交技術(shù)的質(zhì)量管理
    煙草鏡頭與歷史真實(shí)
    聲屏世界(2014年6期)2014-02-28 15:18:09
    熒光原位雜交在慢性淋巴細(xì)胞白血病遺傳學(xué)異常及預(yù)后中的應(yīng)用
    久久人妻熟女aⅴ| 亚洲人成网站在线播| 国产中年淑女户外野战色| 97精品久久久久久久久久精品| 国产精品一二三区在线看| 91精品国产九色| 国产91av在线免费观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产乱人视频| 国产成人精品婷婷| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 伦理电影免费视频| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产欧美亚洲国产| 美女主播在线视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产深夜福利视频在线观看| 国产色婷婷99| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩大片免费观看网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在线观看一区二区三区| 中文欧美无线码| 女人久久www免费人成看片| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧美成人精品一区二区| 在线精品无人区一区二区三 | 日本vs欧美在线观看视频 | 91精品国产国语对白视频| 亚洲精品456在线播放app| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲人成网站在线观看播放| av播播在线观看一区| 搡老乐熟女国产| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 午夜福利在线在线| 色视频在线一区二区三区| 日本黄色片子视频| 国产欧美亚洲国产| 99热网站在线观看| 久久久色成人| 国产午夜精品一二区理论片| 国产真实伦视频高清在线观看| 免费大片18禁| 嘟嘟电影网在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 免费观看性生交大片5| 婷婷色av中文字幕| 五月开心婷婷网| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 直男gayav资源| 亚洲成色77777| 久久99热这里只有精品18| 亚洲成人手机| 老女人水多毛片| 亚洲电影在线观看av| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 日日啪夜夜爽| 身体一侧抽搐| 91久久精品国产一区二区三区| 在线免费十八禁| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产免费一级a男人的天堂| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 色视频www国产| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 99久久中文字幕三级久久日本| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美精品一区二区大全| 国国产精品蜜臀av免费| 免费看日本二区| 免费看光身美女| 日韩中字成人| 午夜福利影视在线免费观看| 久久婷婷青草| 深夜a级毛片| 久久 成人 亚洲| 久久精品国产亚洲av天美| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久久国产一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 看非洲黑人一级黄片| 久久精品久久精品一区二区三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 99国产精品免费福利视频| 免费观看av网站的网址| 97在线视频观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久ye,这里只有精品| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲不卡免费看| 国产伦在线观看视频一区| 国产av码专区亚洲av| 99热国产这里只有精品6| 多毛熟女@视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 涩涩av久久男人的天堂| 黄色配什么色好看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 水蜜桃什么品种好| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲av二区三区四区| 日韩av不卡免费在线播放| 少妇人妻久久综合中文| 日韩成人av中文字幕在线观看| 简卡轻食公司| 人妻系列 视频| 夫妻午夜视频| 久久综合国产亚洲精品| 在现免费观看毛片| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 国产黄片美女视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 午夜福利影视在线免费观看| 成人二区视频| 成人综合一区亚洲| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人黄色视频免费在线看| 国产精品一区二区性色av| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美性感艳星| 高清欧美精品videossex| 中文字幕免费在线视频6| 插逼视频在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| av福利片在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 韩国高清视频一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 大片电影免费在线观看免费| 香蕉精品网在线| 99精国产麻豆久久婷婷| 99九九线精品视频在线观看视频| 中文字幕免费在线视频6| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩精品有码人妻一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 日本与韩国留学比较| 精品久久国产蜜桃| 日韩强制内射视频| 天堂8中文在线网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲内射少妇av| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲色图av天堂| 午夜日本视频在线| 亚洲怡红院男人天堂| 多毛熟女@视频| av女优亚洲男人天堂| 国产久久久一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 高清午夜精品一区二区三区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 91久久精品国产一区二区三区| 黄色视频在线播放观看不卡| 九草在线视频观看| 国产亚洲最大av| 亚洲成人一二三区av| 麻豆成人av视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品久久久久久久久免| 高清在线视频一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 全区人妻精品视频| 美女主播在线视频| 丰满乱子伦码专区| 一本一本综合久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 一区二区av电影网| 视频中文字幕在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产精品国产av在线观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 伦理电影免费视频| 国产在线一区二区三区精| 成人毛片a级毛片在线播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 久久久久久久久久久丰满| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品久久久精品久久久| 高清视频免费观看一区二区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇 在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 人体艺术视频欧美日本| 久久99精品国语久久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产综合精华液| 秋霞在线观看毛片| 日韩欧美一区视频在线观看 | 99久久精品热视频| 久久精品夜色国产| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲国产精品一区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 精华霜和精华液先用哪个| 99久国产av精品国产电影| 人妻一区二区av| 亚洲精品色激情综合| 久久精品久久久久久久性| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 在线看a的网站| 一区二区av电影网| 久久午夜福利片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲成人av在线免费| 国产成人精品婷婷| 成人二区视频| 国产免费福利视频在线观看| 天堂8中文在线网| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲色图av天堂| xxx大片免费视频| 美女内射精品一级片tv| 涩涩av久久男人的天堂| 两个人的视频大全免费| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品一区二区性色av| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 伊人久久精品亚洲午夜| 一区在线观看完整版| 丰满乱子伦码专区| 少妇 在线观看| 在线播放无遮挡| 视频区图区小说| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品久久久久久精品古装| 国产毛片在线视频| 亚洲天堂av无毛| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| .国产精品久久| 亚洲av.av天堂| 九色成人免费人妻av| 下体分泌物呈黄色| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产探花极品一区二区| 精品久久久久久电影网| 丰满少妇做爰视频| tube8黄色片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 老司机亚洲免费影院| 熟女av电影| 亚洲av男天堂| av不卡在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 伊人亚洲综合成人网| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 色精品久久人妻99蜜桃| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 秋霞在线观看毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产成人精品久久二区二区91| 男女国产视频网站| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲国产精品999| 国产福利在线免费观看视频| 黄色片一级片一级黄色片| bbb黄色大片| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲,欧美,日韩| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产99久久九九免费精品| 丁香六月天网| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 99国产精品99久久久久| tube8黄色片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 韩国精品一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 丁香六月天网| 国产亚洲精品久久久久5区| 精品福利永久在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 久久亚洲精品不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 高清不卡的av网站| 亚洲国产看品久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产看品久久| 视频区图区小说| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 日韩制服骚丝袜av| 高清欧美精品videossex| 免费看不卡的av| 操出白浆在线播放| 国产精品久久久久成人av| 免费少妇av软件| 免费看十八禁软件| 国产成人免费无遮挡视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美精品一区二区大全| 亚洲伊人久久精品综合| 精品高清国产在线一区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品自拍成人| 亚洲,一卡二卡三卡| 波多野结衣av一区二区av| 日韩一本色道免费dvd| 午夜免费鲁丝| av在线app专区| 久久精品成人免费网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| 男女免费视频国产| 精品第一国产精品| 97在线人人人人妻| 麻豆av在线久日| 久久青草综合色| 国产亚洲精品第一综合不卡| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产高清国产精品国产三级| 午夜精品国产一区二区电影| 在线看a的网站| 免费在线观看日本一区| 国产高清视频在线播放一区 | 在线观看一区二区三区激情| 久久免费观看电影| 91精品伊人久久大香线蕉| h视频一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 超碰成人久久| 精品少妇黑人巨大在线播放| 一级毛片 在线播放| 少妇 在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| av一本久久久久| 午夜视频精品福利| 满18在线观看网站| 两个人看的免费小视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产色视频综合| 2021少妇久久久久久久久久久| 高清视频免费观看一区二区| 国产成人免费观看mmmm| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩综合久久久久久| 青春草亚洲视频在线观看| av天堂在线播放| 免费看十八禁软件| 亚洲国产欧美网| 另类亚洲欧美激情| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| a 毛片基地| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲综合色网址| 久久久久久人人人人人| 日韩av不卡免费在线播放| 国产免费一区二区三区四区乱码| 精品视频人人做人人爽| 久9热在线精品视频| av不卡在线播放| 成年人免费黄色播放视频| 精品久久蜜臀av无| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人亚洲精品一区在线观看| av天堂久久9| tube8黄色片| 99香蕉大伊视频| 少妇 在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 黄色a级毛片大全视频| 另类精品久久| 欧美xxⅹ黑人| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产成人精品无人区| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产成人免费观看mmmm| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 丁香六月欧美| 亚洲精品一二三| 91麻豆av在线| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产免费福利视频在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 免费少妇av软件| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜两性在线视频| 大话2 男鬼变身卡| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 最黄视频免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成人免费观看视频高清| 久久久久精品国产欧美久久久 | 又紧又爽又黄一区二区| 黑丝袜美女国产一区| 女人精品久久久久毛片| 在线观看www视频免费| 国产福利在线免费观看视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 亚洲国产日韩一区二区| 高清av免费在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产成人av教育| 丰满饥渴人妻一区二区三| 天天操日日干夜夜撸| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品国产av在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜两性在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丝袜美足系列| 在线精品无人区一区二区三| 国产人伦9x9x在线观看| 国产淫语在线视频| 亚洲av男天堂| 午夜精品国产一区二区电影| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产三级黄色录像| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 黄色视频在线播放观看不卡| 99国产精品免费福利视频| √禁漫天堂资源中文www| 精品人妻一区二区三区麻豆| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲三区欧美一区| 一级片免费观看大全| 亚洲欧美清纯卡通| 女人久久www免费人成看片| 国产一区二区 视频在线| 精品人妻在线不人妻| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产成人欧美| 超色免费av| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 电影成人av| 老司机在亚洲福利影院| 在线看a的网站| 不卡av一区二区三区| 国产av精品麻豆| 黄色毛片三级朝国网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 在线观看国产h片| 青春草视频在线免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 久久国产精品影院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| www.精华液| 嫩草影视91久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日日夜夜操网爽| 黄色a级毛片大全视频| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久视频综合| 日本91视频免费播放| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久性视频一级片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产熟女欧美一区二区| 真人做人爱边吃奶动态| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| av天堂在线播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 好男人电影高清在线观看| 美女主播在线视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品成人免费网站| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 久热这里只有精品99| 最新的欧美精品一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 一区在线观看完整版| 成人国产一区最新在线观看 | 日韩视频在线欧美| svipshipincom国产片| 18禁国产床啪视频网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产亚洲欧美在线一区二区| 咕卡用的链子| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品免费视频内射| 欧美日韩成人在线一区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产黄色免费在线视频| 一级a爱视频在线免费观看| 老鸭窝网址在线观看| 曰老女人黄片| 美女大奶头黄色视频| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品 国内视频| 一级黄片播放器| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品一二三区在线看| 国产色视频综合| 国产成人欧美| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 少妇 在线观看| 两性夫妻黄色片| 久久久久久久国产电影| 性少妇av在线| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 国产精品99久久99久久久不卡| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产亚洲av高清不卡| 两性夫妻黄色片| 在线观看www视频免费| 女警被强在线播放| 亚洲人成网站在线观看播放| 咕卡用的链子| 日本av免费视频播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| av国产精品久久久久影院| 欧美精品一区二区大全| 韩国精品一区二区三区| 制服人妻中文乱码| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久网色| 少妇人妻 视频| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲精品国产av成人精品| 国产一区二区三区av在线| 国产在线观看jvid| 日日夜夜操网爽| 日韩一本色道免费dvd| 精品人妻一区二区三区麻豆| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 在线看a的网站| 亚洲 国产 在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲欧美精品自产自拍| 999久久久国产精品视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 成在线人永久免费视频| 妹子高潮喷水视频| 国产男女内射视频| 天天添夜夜摸| 免费看av在线观看网站| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| av网站在线播放免费| 90打野战视频偷拍视频| 久久久精品区二区三区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | av福利片在线| 热99久久久久精品小说推荐| 我要看黄色一级片免费的| 69精品国产乱码久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 最近手机中文字幕大全| 亚洲人成电影免费在线| 1024香蕉在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 婷婷色综合www| 女警被强在线播放| 免费在线观看完整版高清| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 婷婷色综合www| bbb黄色大片| 高清视频免费观看一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 十分钟在线观看高清视频www|