太白草藥馬牙七的成分鑒定及抗氧化作用

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(1.寶雞文理學院 化學化工學院，陜西省植物化學重點實驗室，陜西 寶雞721013；2.寶雞市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 寶雞721001)

馬牙七，別名九子蓮，為蘭科蝦脊蘭屬植物流蘇蝦脊蘭(CalanthefimbriataFranch.)和劍葉蝦脊蘭(CalanthedavidiiFranch.)的假鱗莖和根[1-2]。為多年生草本，其結節(jié)狀的根莖上面橫列有7～10個長卵形的鱗莖或圓柱形的莖基，形似馬牙故而得名。馬牙七分布于我國陜西，甘肅，湖北等地。屬“太白七藥”之一。性涼，味辛，苦。具有清熱解毒，散瘀止痛的功效。用于治療咽喉腫痛，風火牙痛，癰腫，瘰疬，毒蛇咬傷。也用于瘀血阻滯引起的脅痛，胃痛，閉經(jīng)，以及跌打損傷等，療效肯定。但目前馬牙七的應用仍局限于秦嶺當?shù)兀瑢︸R牙七所含化學成分及藥理作用研究的報道極其有限。為開發(fā)和推廣秦嶺地方性藥材，本實驗以流蘇蝦脊蘭(CalanthefimbriataFranch.)為材料，采用一系列化學方法對馬牙七植物所含的化學成分進行初步的鑒定，并進行提取物的抗氧化作用觀察，以便為進一步的研究提供一些實驗室依據(jù)。

1 實驗材料及設備

馬牙七(采自太白縣)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學胡本祥教授鑒定為流蘇蝦脊蘭(CalanthefimbriataFranch.)。茚三酮(上海源葉生物公司)；α-萘酚(上海鼓臣生物)；香草醛(阿拉丁試劑)；鹽酸，濃硫酸，95%乙醇，無水乙醇，酒石酸鉀鈉，無水碳酸鈉，三氯化鐵，三氯化鋁，次硝酸鉍，枸櫞酸，丙酮，醋酸鎂，氫氧化鈉，三氯乙酸，鐵氰化鉀，硫酸銅等均為市售分析純。

XZ-34流水中藥粉碎機(旭朗機械有限公司)；ZF-7型暗箱三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(上海市超聲儀器有限公司)；UV-1200紫外可見分光光度計(鄭州美譜達儀器有限公司)；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)。

2 實驗部分

2.1 前期準備

將馬牙七置于通風處晾干后，分別將根、莖、葉粉碎成粉末狀。分別稱取馬牙七各部位粉末50 g，分別加入500 mL蒸餾水和95%乙醇中，超聲提取40 min，靜置，待沉淀后取上清液過濾，取濾液分別做標記，置于陰涼背光處備用。另取部分上清液經(jīng)濃縮，干燥，研成粉末備用。

2.2 馬牙七中氨基酸的鑒定

分別取各樣品(馬牙七根、莖、葉的水提取物，馬牙七根、莖、葉乙醇提取物)2 mL于試管中，加入1%茚三酮溶液4～5滴，加熱待沸騰5 min后取出冷卻，觀察現(xiàn)象。

2.3 馬牙七中糖類的鑒定

α-萘酚實驗：分別取樣品2 mL于試管中，滴加5% α-萘酚溶液2滴，振搖以使溶液混合，傾斜試管沿管壁滴加濃硫酸4～5滴，觀察現(xiàn)象。

斐林反應：分別取6支試管，加入斐林試劑甲液2 mL，滴入4～5滴斐林試劑乙液，搖勻后立即加入樣品，搖勻靜置。沸水浴下加熱10 min后取出冷卻，觀察現(xiàn)象。

本尼迪克特反應：分別取6支試管，加入樣品2 mL于試管中，加本尼迪克特試劑2 mL，于沸水浴中加熱10 min，取出放置冷去，觀察現(xiàn)象。

2.4 馬牙七中皂苷的鑒定

泡沫實驗：分別取馬牙七水提取物樣品2 mL于3支帶塞試管中，猛烈振搖3 min，觀察現(xiàn)象。

2.5 馬牙七中生物堿的鑒定

碘化鉍鉀實驗：分別取6支試管，加入馬牙七提取物2 mL，加入1 mL稀鹽酸后滴入幾滴碘化鉍鉀溶液，觀察現(xiàn)象。

Marquis呈色反應：分別取6支試管，加入樣品2 mL，加入30%甲醛溶液0.2 mL和濃硫酸10 mL的混合溶液，觀察現(xiàn)象。

線性范圍、檢出限和定量限參照呂謙、楊小玉、王玉紅等[15-19]的方法，將三氯蔗糖標準儲備液用蒸餾水稀釋，分別配制成濃度為40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的5種標準工作液，按1.2節(jié)所述的色譜-質譜條件進行測定，繪制標準工作曲線（圖2）。

2.6 馬牙七中鞣質及酚類的鑒定

三氯化鐵實驗：分別取馬牙七提取物2 mL于試管中，滴加1% FeCl3溶液2～3滴，觀察顏色變化。

香草醛-酸實驗：分別取樣品溶液點于濾紙上，待干燥后，滴入1%香草醛-鹽酸溶液2～3滴于點樣點，觀察是否呈現(xiàn)紅色斑點。

2.7 馬牙七中黃酮類的鑒定

鹽酸-鎂粉實驗：分別取馬牙七提取物2 mL于試管中，加入少量鎂粉后滴加濃鹽酸4～5滴，將試管在沸水浴下加熱幾分鐘并觀察現(xiàn)象。

三氯化鋁實驗：分別取各樣品溶液點于濾紙上，待點樣溶液干燥后，噴霧1%三氯化鋁EtOH溶液于點樣點，在紫外燈下觀察實驗現(xiàn)象。

硼酸丙酮-枸櫞酸丙酮試驗：分別取各樣品2 mL于試管中，將所取樣品在沸水浴下蒸干，向試管中分別加入飽和硼酸丙酮溶液1 mL和10%枸櫞酸丙酮溶液1 mL，振搖，在沸水浴下再次將溶液蒸干，將試管置于紫外燈下，觀察現(xiàn)象。

堿液試驗：分別取潔凈毛細管將樣品點于濾紙上，干后噴霧1%碳酸鈉，觀察現(xiàn)象。

2.8 馬牙七中蒽醌類的鑒定

醋酸鎂反應：分別取馬牙七乙醇提物2 mL于試管中，滴加0.5%乙酸鎂乙醇溶液幾滴，90 ℃水浴加熱5 min，觀察顏色變化。

Borntrager’s反應：分別取馬牙七粉末1 g于試管中，加入10% H2SO4溶液5 mL，水浴條件下加熱10 min。待溶液冷卻后加入乙醚2 mL，振搖試管，靜置片刻分出乙醚層，加入5% NaOH水溶液1 mL，振搖并觀察實驗現(xiàn)象。

2.9 馬牙七提取物還原力的測定

3 結果與討論

3.1 馬牙七提取物中化學成分的判斷

馬牙七根、莖、葉的水提取物及乙醇提取物于加入茚三酮后均呈藍紫色，說明其各部位均含有氨基酸。

馬牙七的根、莖、葉的水及乙醇提取物于α-萘酚實驗時均出現(xiàn)紫色環(huán)，說明各部分均含有糖類。三部分的水提物于菲林反應均呈紅色，三部分的乙醇提取物于本尼迪克特反應均產(chǎn)生紅色沉淀，由此推斷各部分均有還原糖存在。

三種馬牙七水提物于振搖后均有泡沫產(chǎn)生，其中莖部產(chǎn)生大量泡沫，數(shù)分鐘后消失，可推斷馬牙七水提取物都含有皂苷，且莖中含量較高。

于碘化鉍鉀實驗和Marquis呈色反應中，馬牙七根和莖的乙醇提取物均產(chǎn)生紅棕色物，而葉的醇提物及所有水提物無明顯反應，說明其根和莖的乙醇提取物中含有大量的生物堿，在葉中含量較少。水提取物中可能不含或有極少量生物堿。

馬牙七根和莖的水提物于三氯化鐵試驗中均有綠色物生成，于香草醛-酸實驗中均產(chǎn)生紅色斑點，而葉中現(xiàn)象微弱，各醇提物均無明顯陽性反應，表明馬牙七水提取物中含有鞣質和酚類，其中根和莖中含量高于葉。

馬牙七的根、莖、葉的水及乙醇提取物于三氯化鋁試驗中，均產(chǎn)生熒光，于硼酸丙酮-枸櫞酸丙酮試驗中均呈亮青色熒光，于堿液試驗中均呈黃色或亮黃色，可見馬牙七全株均含有黃酮類物質。

馬牙七根、莖、葉水提物于加入乙醚后，乙醚層略顯黃色，加入氫氧化鈉后乙醚層顏色褪去。在醋酸鎂反應中，根和莖的醇提物呈紅棕色及橘黃色，葉中無變化?？梢婑R牙七各部分的不同提取物含有不同的蒽醌類物質。

本實驗通過多種實驗方法測得馬牙七中含有氨基酸、還原糖、多糖、皂苷、鞣質、酚類、黃酮類、蒽醌類等物質。莖中各種化合物的含量最高，根中次之，而葉中含量均較少。

3.2 馬牙七水提取物還原力的測定

由圖1可知，馬牙七水提取物具有較強的還原作用，當馬牙七濃度為0.062 5 mg/mL時，吸光度值僅為0.117，隨著濃度的增大，吸光度值也逐漸增大，當濃度為1 mg/mL時，吸光度值增大到0.812，濃度為2 mg/mL時，吸光度值達1.222，之后隨著濃度的增大吸光度值僅有微弱的增強，濃度為8 mg/mL時，吸光度為1.563，由此判斷，馬牙七水提取物較理想的抗氧化濃度應為2 mg/mL。

圖1 馬牙七水提物的還原力

藥用植物中大多都含有很多種類的化學成分。氨基酸存在于多種植物中。糖類是植物藥中最常見的成分之一，多糖具有多種藥理活性[3-4]。黃酮類也有廣泛的藥理作用[5]，如黃酮苷有降壓、抑菌、利尿作用，槲皮素、杜鵑素有祛痰作用。蒽醌苷類有瀉下作用，有些有抗菌、抗腫瘤作用。人參皂苷有強壯作用，柴胡皂苷有解熱鎮(zhèn)痛作用等。鞣質是具有復雜結構的酚類化合物，也是藥用植物中最常見的一類成分，鞣質在醫(yī)療上常用于收斂止血、止瀉、抗菌消炎等[6-7]。本實驗經(jīng)過一系列化學方法的測定，得知馬牙七中含有氨基酸、還原糖、多糖、皂苷、鞣質、酚類、黃酮類、蒽醌等物質。在馬牙七的莖中各種化合物的含量最高，根次之，而葉中含量均比較少。生物細胞在代謝過程中會產(chǎn)生具有很強氧化性質的過氧化物質，這類物質若不及時地被轉化，則會對細胞內的蛋白質及DNA等造成損傷而影響生物體的正常功能，在這種情況下，具有還原作用的物質在細胞內便發(fā)揮著非常重要的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，馬牙七的根和莖的水提取物具有強的還原性，這方面對生物細胞可起到很好的保護作用。馬牙七成分的進一步分離純化及藥理活性將在今后的工作中繼續(xù)進行。