“三法三穴”推拿手法對坐骨神經(jīng)損傷大鼠運動功能和脊髓NogoA及其受體表達的影響①

李易真，楊超，于天源，魯夢倩，苗潤培，呂桃桃

北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京市100029

推拿能恢復(fù)周圍神經(jīng)損傷后造成的感覺及運動功能失常，并能促進損傷后周圍神經(jīng)修復(fù)和神經(jīng)元存活[1-3]。周圍神經(jīng)損傷后，損傷平面以上出現(xiàn)軸突和神經(jīng)元胞體變性甚至死亡[4]。髓磷脂抑制信號通路在神經(jīng)再生中起重要作用，NogoA是重要的髓鞘相關(guān)蛋白，其活性位點Nogo-66能與其受體NgR結(jié)合，抑制神經(jīng)元再生[5]。本研究觀察坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊髓內(nèi)NogoA及受體NgR的表達，以及“三法三穴”推拿治療的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠64只，體質(zhì)量(200±10)g，購自北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

所有實驗程序均符合動物福利與倫理原則，并經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動物使用和管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

按摩推拿手法模擬儀：中國專利200710187403.1。Mini-P-2電泳槽、電泳儀：美國BIO-RAD公司。Fresco低溫冷凍離心機、MultiSkan3酶標(biāo)儀：美國THERMO公司。水平脫色搖床：北京六一生物科技有限公司。電動組織勻漿器：美國FLUKA公司。

BCA蛋白定量試劑盒、2 mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品、10×TBST(pH=8.0)、彩虹245廣譜蛋白Marker(12條帶)：北京索萊寶科技有限公司。水合氯醛：滬試公司。兔源NgR抗體、兔源NogoA抗體：英國ABCAM公司。

1.3 方法

隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、假手術(shù)組、模型組和推拿組各16只。

模型組和推拿組大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于消毒過的鼠板上，右側(cè)臀股交界處備皮、常規(guī)消毒，沿坐骨神經(jīng)走行剪長約1 cm切口，鈍性逐層分離肌肉，暴露梨狀肌下緣及坐骨神經(jīng)；彎鉤鑷確認坐骨神經(jīng)后，用無齒10號持針器在距梨狀肌下緣5 mm處滿扣夾持坐骨神經(jīng)5 s。逐層縫合，碘伏消毒。

假手術(shù)組同法顯露坐骨神經(jīng)，但不做夾持。正常組不手術(shù)。

各組于造模術(shù)后7 d開始干預(yù)。推拿組束縛后，使用手法模擬儀依次刺激大鼠右側(cè)殷門、承山和陽陵泉[6]；模擬點法、撥法、揉法，力量4 N。每穴每法1 min，30次/min，共9 min。每天1次，治療7次休息1 d。

正常組、假手術(shù)組和模型組同法抓取，不作干預(yù)。

按摩推拿手法模擬儀主要由步進電機、圓盤、壓力傳感器和接觸點等組成，壓力傳感器和接觸點通過金屬條連接，使用導(dǎo)螺桿調(diào)節(jié)壓力。壓力大小顯示在屏幕上。接觸點是直徑10 mm的圓形光滑接觸面。

1.4 檢測方法

于術(shù)后7 d干預(yù)前及干預(yù)20 d時，每組取8只大鼠進行檢測。

1.4.1 斜板測試

斜板由兩塊矩形構(gòu)成，表面鋪厚約6 mm的橡膠墊，斜面角度可測。在室溫、安靜狀態(tài)下，將大鼠頭向前，身體縱軸與斜板縱軸平行放置，逐漸抬高斜板，記錄大鼠能停留5 s而不跌落的最大角度。每只大鼠測量3次，取平均值。

1.4.2 Western blotting

大鼠斜板測試后，腹主動脈取血處死，迅速置于冰盤上，取L4-6節(jié)段脊髓，液氮冷凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

每組選6個樣本組織，加入預(yù)冷RIPA裂解液3 ml充分研磨，12,000 r/min、4℃離心15 min，取上清液。BCA法測定蛋白濃度，取蛋白約10μg，加5倍SDS-PAGE上樣緩沖液。80 V電泳20 min，100 V電泳60 min。120 V轉(zhuǎn)膜120 min。加5%脫脂牛奶封閉60 min，1×TBST 10 min洗1次，共3次。將PVDF膜按蛋白分子量剪開，分別加入NogoA一抗(1∶1000)、NgR 一抗(1∶1000)和內(nèi)參 β-actin 一抗(1∶3000)，搖床室溫孵育60 min，4℃過夜。1×TBST 10 min洗1次，共3次。加HRP-羊抗兔IgG二抗(1∶3000)，室溫搖床孵育60 min。1×TBST 10 min洗1次，共3次。ECL顯影，自然晾干后封存。應(yīng)用Quantity One軟件計算目標(biāo)條帶積分光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，方差均齊，采用LSD t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 斜板測試

術(shù)后7 d，模型組與推拿組大鼠斜板測試評分低于正常組(P<0.05)和假手術(shù)組；干預(yù)20 d時，推拿組大鼠斜板測試評分低于正常組(P<0.05)，高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間點斜板測試結(jié)果(°)

2.2 Western blotting

術(shù)后7 d時，模型組和推拿組NogoA表達與正常組無顯著性差異(P>0.05)；干預(yù)20 d時，推拿組和模型組NogoA表達水平雖有升高趨勢，但仍無顯著性差異(P>0.05)，推拿組和模型組之間也無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

術(shù)后7 d時，模型組和推拿組NgR表達較正常組升高(P<0.05)；干預(yù)20 d時，推拿組NgR表達較模型組降低(P<0.05)，與正常組無顯著性差異(P>0.05)。見圖2、表3。

圖1 各組NogoA蛋白表達(Western blotting)

表2 各組不同時間點NogoA蛋白表達(IOD)

圖2 各組NgRA蛋白表達(Western blotting)

表3 各組不同時間點NgR蛋白表達(IOD)

3 討論

本研究選取的穴位殷門、承山和陽陵泉，屬“穴位-神經(jīng)-肌肉相關(guān)區(qū)域”。此三穴為足太陽膀胱經(jīng)和足少陽膽經(jīng)所過，符合針灸學(xué)循經(jīng)取穴及局部取穴的原則。從解剖學(xué)角度分析，殷門位于坐骨神經(jīng)干處，承山和陽陵泉分別位于坐骨神經(jīng)分支脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)上。三穴周圍為股二頭肌、腓腸肌、脛前肌，是能夠同時刺激穴位、神經(jīng)和肌肉的最佳點。

周圍神經(jīng)通過神經(jīng)元將信息沿感覺和運動纖維傳遞，參與軀體與內(nèi)臟運動、感覺和自主功能調(diào)節(jié)[7]。神經(jīng)損傷后，損傷段的近、遠端將出現(xiàn)一系列病理、生理變化，神經(jīng)元胞體、軸突、髓鞘、末梢感受器均會發(fā)生改變，從而發(fā)生感覺、運動功能障礙[8]。脊髓神經(jīng)元支配周圍神經(jīng)感覺和運動功能，當(dāng)神經(jīng)纖維受損后，支配該部分的脊髓神經(jīng)元和軸突也會受損變性，影響神經(jīng)功能。修復(fù)脊髓神經(jīng)元和軸突，是恢復(fù)周圍神經(jīng)功能的重要一環(huán)。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘中，有3種主要影響神經(jīng)元軸突再生和修復(fù)的髓鞘相關(guān)抑制因子，分別是Nogo蛋白、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白(oligoden-drocyte myelin glycoprotein,OMgp)[9-10]，這3種蛋白通過與其受體蛋白結(jié)合，形成信號通路，發(fā)揮抑制作用。

髓鞘相關(guān)抑制因子中以Nogo蛋白作用最為突出。NogoA的羧基端親水結(jié)構(gòu)域Nogo-66是發(fā)揮抑制作用的主要部分。Fournier等[11]利用堿性磷酸酶融合技術(shù)發(fā)現(xiàn)與NogoA結(jié)合的受體結(jié)構(gòu)NgR。NgR和Nogo-66有高度親和力，兩者結(jié)合形成信號通路，傳導(dǎo)抑制信號，作用于軸突細胞，誘導(dǎo)細胞生長錐坍塌，抑制軸突細胞的生長。抑制NgR1的表達可有效促進神經(jīng)元軸突再生[12]。Liu等[13]發(fā)現(xiàn)，NgR不僅能與NogoA結(jié)合，還能與MAG和OMgp形成復(fù)合體，發(fā)揮同樣的軸突抑制作用。

NgR屬糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，具有多個富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)[14]。NgR需與神經(jīng)營養(yǎng)因子p75(p75NTR)受體[15]和一種特異性定位于神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)Lingo-1[16]特異性結(jié)合，共同介導(dǎo)軸突抑制作用。NogoA作用于神經(jīng)元時，首先與該神經(jīng)元胞膜蛋白中的NgR、p75NTR、Lingo-1結(jié)合，形成復(fù)合物，激活下游信號分子。

NgR是3種髓鞘抑制因子共同作用的靶點。使用NgR拮抗劑阻斷NogoA、MAG和OMgp與NgR的結(jié)合，是目前治療脊髓神經(jīng)元損傷的常用途徑和研究熱點[17]。Gou等[18]發(fā)現(xiàn)，NgR1拮抗劑TAT-NEP1-40可對神經(jīng)元提供保護作用，降低腦梗死容積，促進模型動物神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)。Cao等[19]發(fā)現(xiàn)，NgR拮抗劑NEP1-40能促進側(cè)索損傷大鼠功能恢復(fù)和軸突再生。李鵬等[20]發(fā)現(xiàn)，新型NgR拮抗劑A3NEP1-40能促進周圍神經(jīng)損傷處軸突的延伸，促進大鼠SNI后后肢運動功能恢復(fù)。

本研究顯示，推拿干預(yù)20 d后，能促進SNI大鼠患側(cè)肢體運動功能恢復(fù)。

本研究顯示，SNI大鼠L3-5脊髓內(nèi)NogoA蛋白變化不明顯。閔友江等[21]對脊髓損傷大鼠NogoA蛋白不同時相的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)術(shù)后21 d時，NogoA含量達到峰值。周圍神經(jīng)損傷后大鼠脊髓中NogoA的時相變化沒有檢索到相關(guān)文獻，需要進一步研究。推拿干預(yù)20 d后，大鼠NogoA蛋白有升高趨勢，與模型組相似，表明推拿對NogoA蛋白的抑制作用不明顯。李小琴等[22]發(fā)現(xiàn)，電針能抑制MAG蛋白表達，促進軸突再生，促進大鼠運動功能恢復(fù)。

本研究顯示，SNI大鼠L3-5脊髓內(nèi)NgR蛋白表達增高，可能與軸突逆行性損傷導(dǎo)致抑制通路激活有關(guān)。SNI后，損傷平面以上的神經(jīng)元軸突也出現(xiàn)損傷，引起髓磷脂抑制因子表達增高，NgR表達升高，發(fā)揮軸突抑制作用。推拿干預(yù)20 d后，NgR蛋白降低，可能是推拿發(fā)揮治療作用的機制之一。

前期研究顯示，推拿殷門、承山、陽陵泉可顯著改善大鼠感覺及運動功能，上調(diào)神經(jīng)生長因子、神經(jīng)絲蛋白等，保護神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[23-25]。Pan等[26]研究顯示，推拿能調(diào)節(jié)損傷點遠端組織型纖溶酶原激活物與纖溶酶原激活物抑制劑的穩(wěn)態(tài)，維持微環(huán)境修復(fù)能力，使其趨近于正常狀態(tài)，預(yù)防和解除膠原纖維形成結(jié)締組織瘢痕，為突觸重塑提供良好環(huán)境。推拿通過降低SNI大鼠脊髓中MAG和Rho相關(guān)激酶2的表達，抑制微管與神經(jīng)絲解聚，維護神經(jīng)元細胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[27]。

NogoA通過與NgR結(jié)合發(fā)揮軸突抑制作用。推拿可降低脊髓中NgR蛋白表達，促進軸突再生，起到類似NgR拮抗劑的作用。其機理可能包括抑制Ca2+內(nèi)流、穩(wěn)定神經(jīng)遞質(zhì)濃度、上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌等多種途徑，有待進一步研究。

綜上所述，推拿手法可通過降低SNI后NgR蛋白在相應(yīng)節(jié)段脊髓內(nèi)的表達，阻斷軸突抑制通路的激活，保護神經(jīng)元，進而促進軸突再生，最終改善SNI大鼠運動功能。