甜菜突變體庫(kù)的構(gòu)建研究綜述

包永鎮(zhèn)，崔 杰，代翠紅

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，哈爾濱 150086)

0 前言

甜菜(Beta vulgaris L.)是二年生草本植物，屬藜科(Polygonaceae)甜菜屬[1]。甜菜具有一定抵御干旱、寒冷和耐鹽堿的能力，是一種適應(yīng)能力和抗逆能力較強(qiáng)的糖料作物。甜菜種植在國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展中起到積極促進(jìn)的作用。如甲醇、乙醇、丁醇、甘油、谷氨酸鈉和丙酮的生產(chǎn)，可以由經(jīng)過(guò)發(fā)酵或化學(xué)處理的糖蜜來(lái)進(jìn)行。它還可以用作許多藥物和輕工業(yè)產(chǎn)品的原料，例如三磷酸腺苷、金霉素、維生素B復(fù)合物、蛋白質(zhì)酵母和檸檬酸。糖生產(chǎn)后的過(guò)濾污泥富含鈣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，既可作為肥料，也可作為土壤中的游離酸。甜菜莖，青頭，尾根和甜菜粕可用作釀造原料、提取甜菜堿等，同時(shí)是優(yōu)質(zhì)多汁的飼料[2-3]。

作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，我國(guó)擁有的種植技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)十分豐富。雖然中國(guó)有野生甜菜資源，但在甜菜遺傳育種方面資源仍舊匱乏，主要的方式還是依賴(lài)于引進(jìn)。雖然目前有許多自主培育品種，但其生產(chǎn)質(zhì)量仍存在一定差距。中國(guó)在五十年代到六十年代主要從自蘇聯(lián)、波蘭和其他國(guó)家引進(jìn)甜菜資源。由于品種單一，野生資源較為罕見(jiàn)，這在一定程度上限制了育種工作的發(fā)展[4]。另外，由于甜菜病害和鹽堿土地種植會(huì)導(dǎo)致甜菜產(chǎn)量降低，如甜菜苗期主要病害立枯病、2014年我國(guó)河北省和內(nèi)蒙古兩地甜菜種植區(qū)紙筒育苗苗期甜菜葉片上出現(xiàn)的新的葉部枯斑病害[5]、甜菜褐斑病等。因而對(duì)中國(guó)甜菜糖業(yè)來(lái)講，產(chǎn)糖高、耐鹽堿性和抗病性強(qiáng)的甜菜新品種的培育至關(guān)重要。

目前，誘變育種已成功應(yīng)用于許多作物品種，并建立了較全面的突變體庫(kù)。但將甜菜突變體的研究應(yīng)用在遺傳育種的報(bào)道并不多。因此，本文將探討甜菜突變體庫(kù)的構(gòu)建。

1 我國(guó)在甜菜育種方面存在的問(wèn)題

中國(guó)甜菜育種存在的問(wèn)題主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)雖然東北、華北和西北等主要產(chǎn)糖區(qū)有10多個(gè)專(zhuān)業(yè)甜菜種植機(jī)構(gòu)，但是，這些育種機(jī)構(gòu)之間的協(xié)調(diào)不夠好，導(dǎo)致反復(fù)研究，研究?jī)?nèi)容重復(fù)含量高，研究?jī)?nèi)容難以深化等；(2)甜菜育種工作者經(jīng)過(guò)數(shù)十年的引進(jìn)、收集和鑒定，已有1 200多種甜菜種質(zhì)資源在國(guó)內(nèi)編制和編目長(zhǎng)期保存。然而，我國(guó)現(xiàn)有的甜菜種質(zhì)資源仍不完整，并且數(shù)量短缺。種質(zhì)間遺傳關(guān)系較為密切，遺傳基因較窄，嚴(yán)重影響了我國(guó)甜菜育種的有效發(fā)展；(3)我國(guó)目前種植的甜菜品種產(chǎn)量不高，平均低于45 t/hm2；一些發(fā)達(dá)國(guó)家甜菜單產(chǎn)超過(guò)60 t/hm2；(4)中國(guó)大量種植的大多數(shù)品種都是用20世紀(jì)50年代到60年代進(jìn)口的材料。目前，我們的大部分育種基礎(chǔ)材料已經(jīng)結(jié)合在一起，所以如果我們想要在育種上取得突破性的進(jìn)展，很難只用現(xiàn)有的育種材料來(lái)做到這一點(diǎn)；(5)中國(guó)目前的甜菜育種技術(shù)水平與發(fā)達(dá)國(guó)家差距較大，自身育種技術(shù)較少；(6)目前，發(fā)達(dá)國(guó)家基本上使用單粒種子，中國(guó)使用的品種仍然是多粒種子[6]。

2 構(gòu)建突變體庫(kù)的目的與意義

突變是生物進(jìn)化的重要途徑和驅(qū)動(dòng)力，也為品種改良提供了初始原料。突變體庫(kù)是由許多不同類(lèi)型的基因突變體組成的集合體。在分離和鑒定功能基因和遺傳改良工作中，突變體已經(jīng)成為重要的基礎(chǔ)研究材料，通過(guò)誘變技術(shù)構(gòu)建突變體文庫(kù)來(lái)創(chuàng)造新種質(zhì)資源已成為可靠有效的手段[7]。目前通過(guò)對(duì)相同環(huán)境條件下突變體與其野生型植物之間基因表達(dá)的差異進(jìn)行比較，獲得相關(guān)功能基因的重要信息，是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且有效的方法。

在國(guó)際上，基本材料的收集和基礎(chǔ)材料的創(chuàng)建受到高度重視，我國(guó)在這方面也給予了相當(dāng)?shù)年P(guān)注。構(gòu)建甜菜突變體文庫(kù)，集中各種優(yōu)良性狀，培育和創(chuàng)造近等基因系，不僅為基因功能分析提供了材料，它還可以豐富種質(zhì)資源，擴(kuò)大我國(guó)甜菜的狹窄基因源，促進(jìn)集中鑒定和應(yīng)用，使其可以直接或間接地應(yīng)用于育種，為遺傳研究和育種提供大量基礎(chǔ)材料[9]。

3 甜菜突變體的構(gòu)建方法

自然突變和誘導(dǎo)突變是產(chǎn)生突變體的兩種方式。由于自然突變具有突變頻率低、突變不定向并且大部分對(duì)生物有害等特點(diǎn)，目前在創(chuàng)建突變體的研究上多采用誘發(fā)突變。誘導(dǎo)突變是指利用人為方法誘導(dǎo)生物體的表型或遺傳信息產(chǎn)生突變，這些突變通常用作功能基因的發(fā)現(xiàn)，改善培育優(yōu)良的新作物品種。由于操作技術(shù)的不同，誘發(fā)突變可分為物理誘變，化學(xué)誘變，空間誘變和生物誘變。目前創(chuàng)造作物突變體的首要方法是誘發(fā)突變。突變頻率高且有目的性，突變基因主要是一些重要的品質(zhì)性狀基因[11]。

3.1 物理誘變

物理誘變是指使用物理誘變劑對(duì)生物體進(jìn)行處理，以引起受試對(duì)象發(fā)生表型或遺傳變異的誘變方法。主要的輻射方法為電磁輻射和粒子輻射。電磁輻射包括無(wú)線(xiàn)電波、微波、光波、紫外線(xiàn)、X射線(xiàn)和伽馬射線(xiàn)等。在較早的誘變?cè)囼?yàn)中，人們常用的輻射源為X射線(xiàn)，成功制造了許多有重要研究?jī)r(jià)值的新材料。伽馬射線(xiàn)是目前物理輻射誘變中最常用的輻射源。粒子輻射源有α粒子、β粒子、中子、質(zhì)子、電子和離子束等。其中，由于高能離子束的高能量傳輸線(xiàn)密度(LET)和尖銳的布拉格峰，可以使突變頻率大大提高，突變譜更為廣泛。因此，它作為誘變育種研究中一種重要的技術(shù)手段具有十分廣闊的應(yīng)用前景。王燕飛等[12-13]將甜菜雜交種為研究材料開(kāi)展甜菜種子離子注入研究，以N+作輻射源，分別使用35 kev能量，脈沖次數(shù)為40次和60次，以4×1016N+/cm2和6×1016N+/cm2為注射劑量分別進(jìn)行輻射誘變。對(duì)甜菜雜交種的分析研究表明，雜交種的產(chǎn)量和含糖量均明顯提高，經(jīng)過(guò)6年的130次實(shí)驗(yàn)，獲得了267個(gè)測(cè)試數(shù)據(jù)，并獲得了一份創(chuàng)新的早熟親本材料，兩種具有優(yōu)良綜合性狀的創(chuàng)新親本材料，表現(xiàn)為產(chǎn)量和含糖量增加[14]。張?jiān)虑俸婉R龍珍對(duì)未授粉的甜菜胚珠及其產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行紫外線(xiàn)照射處理，并以一定濃度的褐斑病粗提物進(jìn)行選擇處理，獲得了具有抗甜菜褐斑病的甜菜品種；韓曉云等對(duì)培甜菜與白花甜菜雜交及回交得到的異源三倍體與栽培甜菜回交得到的單體附加系M14的種子進(jìn)行γ射線(xiàn)照射，使易位系的產(chǎn)生速度增加，使易位系的頻率從0.3%增加到2.3%[15-16]。

3.2 化學(xué)誘變

操作方便、成本低廉是化學(xué)誘變技術(shù)的主要特征。化學(xué)誘變劑主要包括堿基類(lèi)似物(如5-溴-尿嘧啶)，烷化劑(如EMS)，抗生素等[17]。化學(xué)誘變技術(shù)是構(gòu)建突變體文庫(kù)的重要手段之一?；瘜W(xué)誘變劑直接通過(guò)化學(xué)作用在染色體中起重要作用。甲基磺酸乙酯(EMS)是公認(rèn)最好的化學(xué)誘變劑之一，利用EMS作為誘變劑創(chuàng)造突變體已成為世界上成熟的技術(shù)。其誘變機(jī)理是通過(guò)與核苷酸中的磷酸和嘌呤或嘧啶作用，從而誘導(dǎo)突變的發(fā)生。EMS誘導(dǎo)產(chǎn)生突變體分為兩步：第一步是鳥(niǎo)嘌呤的C6位發(fā)生烷基化，第二步是在DNA進(jìn)行復(fù)制過(guò)程中，被烷基化的鳥(niǎo)嘌呤與胸腺嘧啶進(jìn)行配對(duì)，從而發(fā)生堿基交換，即堿基對(duì)由G：C轉(zhuǎn)變?yōu)锳：T，造成點(diǎn)突變。由于EMS誘變技術(shù)多是由點(diǎn)突變的發(fā)生而制造突變體，不易導(dǎo)致染色體畸變的發(fā)生，因此構(gòu)建突變體文庫(kù)多采用EMS誘變。目前，已經(jīng)對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、番茄和大麥中等植物利用 EMS誘變技術(shù)進(jìn)行了突變體庫(kù)的構(gòu)建，并且進(jìn)行了相關(guān)功能基因組學(xué)的研究。1994-1996年，齊桂杰等人用秋水仙堿誘導(dǎo)了42份甜菜四倍體穩(wěn)定系。選擇了三條高產(chǎn)品系列和八條高糖系列，為甜菜多倍體育種創(chuàng)造了有價(jià)值的研究材料[18]。姜莉等確定了甜菜授粉系材料SN9807種子萌發(fā)致死率(半致死劑量)，最佳誘變處理組合為時(shí)間10 h、EMS濃度2.5%和時(shí)間12 h、EMS濃度2.3%[19]。

3.3 空間誘變

植物空間誘變是指將植物材料通過(guò)返回的衛(wèi)星和高空氣球攜帶到離地球20至400公里的高度飛行，通過(guò)宇宙射線(xiàn)、微重力、弱地磁等對(duì)作物材料進(jìn)行誘變處理，然后返回地面種植和育種，以獲得優(yōu)良的新品種或特殊種質(zhì)材料[20]。自1987年以來(lái)，衛(wèi)星或宇宙飛船攜帶了100多種植物的1000多種種子和組織培養(yǎng)苗，包括大米、小麥、大麥、高粱、玉米、棉花、甜菜、蓮子等。劉華軍、王燕飛等選擇培育純合二倍體系B63，四倍體系7208于1996年乘坐回歸衛(wèi)星。試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同多倍體的甜菜種子的敏感性經(jīng)過(guò)空間誘變處理后表現(xiàn)出明顯的不同。與對(duì)照相比，四倍體材料在生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出某些性狀受到抑制，生長(zhǎng)期延遲，種子干粒重減少5%～25%，塊根產(chǎn)量下降26.5%～47%；而二倍體材料的生長(zhǎng)卻表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，并且生長(zhǎng)潛力得到提升。初步研究分析表明，外太空環(huán)境不僅影響植物的生理狀態(tài)，還影響植物的遺傳[21]。劉乃新等測(cè)定了經(jīng)空間誘變處理的3個(gè)不同品種的甜菜及其對(duì)照材料花蕾組織中4種激素(IAA，GA3，ABA和ZR)的含量，結(jié)果表明：與對(duì)照相比，在甜菜的生殖生長(zhǎng)階段，空間突變株中的激素含量發(fā)生了很大變化，然而，不同品系之間存在一定的差異，表明在復(fù)雜的環(huán)境條件下，不同的個(gè)體變體是多樣的，需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明其突變的機(jī)制[22]。

3.4 生物誘變

生物誘變是指采用生物工程方法對(duì)生物遺傳信息進(jìn)行編輯和轉(zhuǎn)化以誘導(dǎo)突變的研究方法。由插入序列產(chǎn)生的突變通常用于增加或減少基因的表達(dá)或通過(guò)外源或內(nèi)在插入植物基因組DNA中來(lái)刪除基因的功能。T-DNA插入突變，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，基因沉默等是主要的生物誘變技術(shù)。生物誘變技術(shù)尚未見(jiàn)在甜菜育種應(yīng)用方面進(jìn)行報(bào)道，但在其他作物育種中已進(jìn)行了較多的應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，甜菜誘變育種技術(shù)取得了一定的進(jìn)展，但作為非甜菜原產(chǎn)國(guó)的中國(guó)，種質(zhì)資源相對(duì)較少，甜菜誘變育種技術(shù)的發(fā)展對(duì)中國(guó)來(lái)說(shuō)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。我國(guó)目前對(duì)于甜菜突變體庫(kù)的研究比較薄弱，而且最近有關(guān)甜菜突變體構(gòu)建的報(bào)道極其微少，很多報(bào)道都是多年以前的研究。目前擁有的優(yōu)質(zhì)甜菜材料的數(shù)量和類(lèi)型完全不能達(dá)到對(duì)甜菜功能基因組學(xué)研究和遺傳育種的需要。因此，我們應(yīng)該加強(qiáng)各種類(lèi)型突變的創(chuàng)造，并研究突變體和對(duì)照之間農(nóng)藝性狀，質(zhì)量和抗逆性的差異。為功能基因組學(xué)的研究構(gòu)建各種不同類(lèi)型的突變體庫(kù)；利用誘變技術(shù)獲得新的遺傳性狀和種類(lèi)，為遺傳育種和新的種質(zhì)資源研究提供充足的基礎(chǔ)材料。