白皮杉醇對DN大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

張?jiān)葡?，邱書娟，孫秀菊，郭振濤，郭民

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濰坊261031)

糖尿病腎病(DN)是臨床最常見的微血管并發(fā)癥之一，也是引起慢性腎臟疾病和終末期腎病的重要原因。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在內(nèi)皮細(xì)胞損傷中具有重要作用，而DN發(fā)病的重要環(huán)節(jié)是腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1]。因此，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可改善腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，延緩DN進(jìn)展。白皮杉醇(PIC)是白藜蘆醇的衍生物，主要存在于葡萄、大黃、甘蔗等植物中，是一種多酚化合物。研究證實(shí)，PIC具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抑制炎癥反應(yīng)、抗細(xì)胞凋亡等作用[2]，尤其在抗氧化應(yīng)激方面較白藜蘆醇效果更明顯。但目前國內(nèi)對PIC的研究較少，其作用機(jī)制亦不十分清楚。為此，2016年11月～2017年12月，我們觀察了PIC對DN大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠50只，清潔級，8周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每5只1籠，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度21～23 ℃、濕度50%～60%、自然晝夜節(jié)律光照。PIC，杭州廣林生物醫(yī)藥公司；鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司。所有引物由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。Modular DPP全自動(dòng)生化分析儀，瑞士Roche公司；RM-2145石蠟切片機(jī)，德國徠卡公司；梯度PCR儀、核酸蛋白測定儀，德國Eppendor公司。大鼠內(nèi)皮素1(ET-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒，上海谷研生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司；兔抗大鼠p38 MAPK、TNF-α單克隆抗體，美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物分組處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、模型組及PIC低、中、高劑量組，每組10只。模型組及PIC低、中、高劑量組高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，給予STZ 30 mg/kg一次性腹腔注射，制備DN模型。腹腔注射次日，PIC低、中、高劑量組分別給予PIC 50、100、200 mg/(kg·d)灌胃，模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)灌胃12周。對照組普通飼料喂養(yǎng)，不予注射STZ，同期等量生理鹽水灌胃。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 腎功能及血糖 各組灌胃12周末，置于代謝籠中，留取24 h尿液，采用全自動(dòng)生化分析儀、免疫透射比濁法檢測24 h尿白蛋白(U-Alb)；禁食12 h，3%水合氯醛100 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉完全后腹主動(dòng)脈取血3 mL，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)及血清肌酐(Scr)、胱抑素C(Cys-C)。

1.3.2 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能及氧化應(yīng)激狀態(tài) 各組麻醉完全后無菌條件下摘取右側(cè)腎臟，于冰冷的生理鹽水中漂洗。取適量腎組織，充分研磨，制成10%組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清。采用ELISA法檢測上清液ET-1、VEGF，硝酸還原酶法檢測上清液NO，黃嘌呤氧化酶法檢測上清液SOD活力，比色法檢測上清液MDA含量。所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.3 腎組織病理形態(tài) 取部分腎皮質(zhì)，10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟至水，1%高碘酸氧化10 min，蒸餾水沖洗；Schiff氏液避光染色10 min，蒸餾水沖洗；0.5%偏重亞硫酸鈉浸洗2次，蒸餾水沖洗；蘇木素染核3～5 min，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗；1%氨水返藍(lán)，流水沖洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)400倍無重疊視野，觀察腎小球、腎小管、系膜基質(zhì)病理形態(tài)及炎性細(xì)胞浸潤情況。

1.3.4 腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、TNF-α表達(dá) ①腎組織p38 MAPK、TNF-α mRNA表達(dá)：采用RT-PCR法。取部分腎組織，按TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)和2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，提取的總RNA符合實(shí)驗(yàn)要求。按cDNA合成試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：p38 MAPK上游引物5′-AGGGCGATGTGACGTTTG-3′，下游引物5′-CTGGCAGGGTGAAGTTGG-3′，擴(kuò)增片段1 083 bp；TNF-α上游引物5′-TGATCGGTCCCAACAAGGA-3′，下游引物5′-TGCTTGGTGGTTTGCTACGA-3′，擴(kuò)增片段368 bp；β-actin上游引物5′-GGCATCCACGAATCTACCT-3′，下游引物5′-GCTGTCACCTTCACCGTTC-3′，擴(kuò)增片段480 bp。PCR反應(yīng)體系共25 μL：10×擴(kuò)增緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.4 μL，模板cDNA 2.0 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃(p38 MAPK)、53 ℃(TNF-α)或57 ℃(β-action)退火30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以β-action為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。②腎組織p38 MAPK、TNF-α蛋白表達(dá)：采用免疫組化法。取上述石蠟切片，置于60 ℃烘箱烘片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液加熱抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15 min，分別加入兔單克隆抗p38 MAPK、TNF-α一抗，37 ℃孵育2 h；然后加入生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。用美國Sigma公司提供的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。p38 MAPK陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕褐色；TNF-α陽性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。每張切片隨機(jī)取10個(gè)400倍不重疊視野，采用Image-Pro Plus軟件分析每視野光密度值，以此代表目的蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖及腎功能相關(guān)指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組血糖和腎功能相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

2.2 各組內(nèi)皮細(xì)胞功能和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 見表2。

表2 各組內(nèi)皮細(xì)胞功能和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

2.3 各組腎組織病理形態(tài)觀察 對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，基底膜厚度正常，間質(zhì)中未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。模型組出現(xiàn)明顯腎小球和腎小管基底膜增厚，系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞脫落、空泡變、管腔擴(kuò)大，結(jié)構(gòu)紊亂伴有萎縮，毛細(xì)血管腔嚴(yán)重受壓。與模型組比較，PIC各組腎組織損傷減輕，且隨著PIC濃度升高，腎組織損傷逐漸減輕。

2.4 各組p38 MAPK、TNF-α表達(dá)比較 見表3。

表3 各組p38 MAPK、TNF-α mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與PIC低劑量組比較，△P<0.05；與PIC中劑量組比較，▲P<0.05。

3 討論

DN是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，即使嚴(yán)格控制血糖、規(guī)律應(yīng)用ACEI/ARB類藥物亦不能阻止其進(jìn)展。研究證實(shí)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷是DN發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一[3]。長期高血糖會(huì)通過激活蛋白激酶C通路、糖基化終產(chǎn)物蓄積、激活血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、氧化應(yīng)激等途徑損傷內(nèi)皮細(xì)胞，其電荷屏障和機(jī)械屏障破壞可導(dǎo)致蛋白尿，引起炎癥免疫反應(yīng)，繼而導(dǎo)致系膜基質(zhì)增生、腎小球硬化等[3，4]。內(nèi)皮細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如NO、ET-1、VEGF等，調(diào)控這些細(xì)胞因子可改善腎內(nèi)微循環(huán)，抑制炎癥細(xì)胞浸潤，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。高血糖可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，NO等舒張血管物質(zhì)生成減少，ET-1等收縮血管物質(zhì)生成增多[5]，同時(shí)IL-8、IL-1、VEGF等細(xì)胞因子生成增多，促進(jìn)腎臟炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷及腎臟纖維化[6]。本研究模型組腎組織ET-1、VEGF明顯增多，NO明顯降低，證實(shí)DN大鼠腎組織存在明顯內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

PIC是白藜蘆醇的衍生物，主要存在于葡萄、大黃、甘蔗等植物中，是白藜蘆醇的羥基化衍生物，也是其代謝產(chǎn)物。研究證實(shí)，PIC具有抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡、抑制炎癥反應(yīng)等作用，尤其在抗氧化應(yīng)激方面效果更明顯[7]。有研究表明，PIC預(yù)處理能夠抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，增加NO生成，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]；PIC還能通過活化PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶合成，促進(jìn)NO釋放，繼而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[9]。此外，PIC還能減輕胰島素抵抗，降低糖尿病小鼠血糖水平[10]。而DN的發(fā)生與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激密切相關(guān)，故PIC有可能延緩DN進(jìn)展。但目前相關(guān)研究報(bào)道較少。

為探討PIC對DN的作用效果，本研究對DN大鼠給予PIC 50、100、200 mg/(kg·d)灌胃處理12周，觀察其血糖、腎功能、內(nèi)皮細(xì)胞功能及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，模型組血糖和腎功能相關(guān)指標(biāo)均明顯高于對照組；腎組織NO水平、SOD活性均明顯低于對照組，ET-1、VEGF水平及MDA含量均明顯高于對照組；且其腎組織出現(xiàn)明顯損傷，而對照組腎組織未見明顯異常。表明DN大鼠可出現(xiàn)明顯的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，且其損傷可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，PIC各組均能改善腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，且隨著PIC濃度升高，其效果越來越明顯。表明PIC能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能，延緩DN進(jìn)展。

p38 MAPK是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠調(diào)控炎癥因子分泌[11]，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。因此，在信號通路水平阻斷和調(diào)控MAPK表達(dá)，可減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子均可引起p38 MAPK通路活化[12,13]，磷酸化的p38 MAPK入核后又能通過調(diào)控NF-κB等基因表達(dá)，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子，使得炎癥反應(yīng)級聯(lián)擴(kuò)大，加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷[14,15]。為探討PIC的作用機(jī)制，我們觀察了各組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達(dá)明顯高于對照組，表明DN大鼠體內(nèi)存在明顯的p38 MAPK通路激活。既往研究發(fā)現(xiàn)，抑制p38 MAPK通路活化能抑制內(nèi)皮細(xì)胞釋放炎癥因子，緩解炎癥反應(yīng)[16，17]。本研究結(jié)果顯示，PIC各組腎組織p38 MAPK、TNF-α表達(dá)均明顯低于模型組，且隨著PIC濃度升高，其效果越來越明顯。表明PIC可能通過抑制p38 MAPK通路活化，減輕炎癥反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮腎小球內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，PIC能劑量依賴性地減輕腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保護(hù)腎功能，延緩DN進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與抑制p38 MAPK通路活化，減輕炎癥反應(yīng)、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。