七氟醚與丙泊酚麻醉患者含藥血清對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制

姜虹宇，徐遠(yuǎn)志，趙耀東，樓美清，時(shí)飛

(1無錫市第三人民醫(yī)院，江蘇無錫214000；2 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院)

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人最常見和最致命的原發(fā)性惡性腦腫瘤，患者預(yù)后很差[1]，手術(shù)聯(lián)合放化療僅能延長患者2～4個(gè)月的生存期[2]。七氟醚是臨床常用的吸入麻醉誘導(dǎo)藥物。有研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚在體外可抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移[3]。丙泊酚是臨床廣泛使用的靜脈麻醉藥物，其對(duì)機(jī)體免疫力的影響以及與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系已引起關(guān)注。但不同麻醉藥物對(duì)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響可能不同[4]。2016年6月～2018年6月，本研究比較了七氟醚與丙泊酚麻醉患者含藥血清在體外對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系SHG-44(以下稱SHG-44細(xì)胞)，購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀，美國BD公司；Transwell系統(tǒng)，美國康寧公司。CCK-8試劑盒，日本Dojindo公司；Annexin V Apoptosis Detection Kit、Cycletest Plus DNA Reagent Kit，美國BD Bioscience公司。

1.2 含藥血清制備 選擇2016年6月～2018年6月無錫市第三人民醫(yī)院收治的膠質(zhì)瘤患者30例。所有患者符合《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南(2015)》，WHO分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)。排除術(shù)前接受放化療者、術(shù)前1個(gè)月出現(xiàn)急慢性感染或免疫系統(tǒng)疾病者。隨機(jī)將患者分為對(duì)照1組、七氟醚1組、丙泊酚1組，每組10例。其中，對(duì)照1組男6例、女4例，年齡(50±8)歲，體質(zhì)量(60±8)kg，ASA分級(jí)Ⅰ級(jí)4例、Ⅱ級(jí)6例；七氟醚1組男7例、女3例，年齡(53±10)歲，體質(zhì)量(53±12)kg，ASA分級(jí)Ⅰ級(jí)4例、Ⅱ級(jí)6例；丙泊酚1組男8例、女2例，年齡(44±5)歲，體質(zhì)量(56±10)kg，ASA分級(jí)Ⅰ級(jí)5例、Ⅱ級(jí)5例。三組性別、年齡、體質(zhì)量、ASA分級(jí)具有可比性。所有患者術(shù)前禁食、禁水10 h，入室后常規(guī)開放靜脈通道，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓、心率、腦電雙頻指數(shù)等。七氟醚1組氣管插管后連接呼吸機(jī)機(jī)械通氣，采用丙泊酚2 mg/kg、咪達(dá)唑侖0.1 mg/kg麻醉誘導(dǎo)，七氟醚維持麻醉，呼氣末濃度維持1.5～2.0 MAC。丙泊酚1組氣管插管后連接呼吸機(jī)機(jī)械通氣，丙泊酚TCI模式輸注1.5 μg/mL、咪達(dá)唑侖0.1 mg/kg麻醉誘導(dǎo)，丙泊酚維持麻醉，氣流量為2 L/min。七氟醚1組和丙泊酚1組術(shù)中根據(jù)引流量、尿量等計(jì)算液體損失量，以等量乳酸鈉林格氏溶液補(bǔ)充，分別于手術(shù)結(jié)束即刻采集頸內(nèi)靜脈血15 mL，置于含肝素鈉的真空采血管。對(duì)照1組于手術(shù)麻醉前采集頸內(nèi)靜脈血15 mL，置于含肝素鈉的真空采血管。所有標(biāo)本離心后留取血清，-70 ℃保存。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 將SHG-44細(xì)胞接種于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天按1∶2傳代1次。取傳3代對(duì)數(shù)生長期SHG-44細(xì)胞，接種于6孔板中，隨機(jī)分為對(duì)照2組、七氟醚2組、丙泊酚2組。各組常規(guī)培養(yǎng)12 h，分別加入上述制備的含藥血清200 μL繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72 h，加入CCK-8溶液10 μL，再培養(yǎng)2 h。另設(shè)空白孔，僅加入等量的CCK-8溶液。酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測(cè)各孔的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD450值-空白孔OD450值)/(對(duì)照孔OD450值-空白孔OD450值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 取傳3代對(duì)數(shù)生長期SHG-44細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照2組、丙泊酚2組、七氟醚2組，每組1×104個(gè)，分別加入添加插件的Transwell小室上室，插件內(nèi)為低濃度血清培養(yǎng)基，Transwell小室下室加入高濃度血清培養(yǎng)基，然后在Transwell小室上室插件內(nèi)加入相應(yīng)含藥血清200 μL，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，取出插件，用濕棉簽輕輕擦去插件表面的Matrigel凝膠和聚碳酸脂膜表面的細(xì)胞后，甲醇固定，1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)400倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 取傳3代對(duì)數(shù)生長期SHG-44細(xì)胞，接種于6孔板，隨機(jī)分為對(duì)照2組、丙泊酚2組、七氟醚2組，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合基本鋪滿板底，用1 mL移液器槍頭尖端在每孔表面作一條過孔心的直線，PBS徹底漂洗，吸取細(xì)胞碎片后，顯微鏡下拍照。然后各孔分別加入相應(yīng)含藥血清200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照。采用Image J軟件測(cè)量細(xì)胞劃痕間距。細(xì)胞遷移率=(初始距離-最后距離)/初始距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 取傳3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，每孔2×105個(gè)，隨機(jī)分為對(duì)照2組、丙泊酚2組、七氟醚2組，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，各組分別加入相應(yīng)含藥血清200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，冷PBS洗滌，1倍緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×106/mL。取細(xì)胞懸液100 μL至5 mL離心管中，再加入Annexin V-PE 5 μL和7-AAD 5 μL，25 ℃、黑暗環(huán)境下孵育15 min，然后加入1倍緩沖液400 μL，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果采用ModFit軟件分析。

1.7 NF-κB 、Cyclin D1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白芯片技術(shù)。取傳3代對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，每孔2×105個(gè)，隨機(jī)分為對(duì)照2組、丙泊酚2組、七氟醚2組，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，各組加入Full moon芯片專用細(xì)胞裂解液100 μL充分裂解，抽提細(xì)胞總蛋白，- 80 ℃保存。各組取細(xì)胞總蛋白25 μg，加入Labeling Buffer至總體積67 μL，按照配套提供的雜交標(biāo)準(zhǔn)流程和試劑盒進(jìn)行芯片洗滌與檢測(cè)。在培養(yǎng)皿中加入封閉液30 mL，完全浸沒蛋白芯片。將培養(yǎng)皿置于搖床上，55 r/min室溫封閉45 min，Milli-Q水洗滌；然后將芯片置于干凈的培養(yǎng)皿中，緩慢將6 mL Protein Coupling Mix滴加到芯片表面。完全浸沒芯片，蓋上Coupling Chamber，35 r/min室溫?fù)u床上反應(yīng)2 h。取出芯片，干燥后掃描。采用GenePix Pro6.0軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率比較 見表1。

表1 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對(duì)照2組比較，*P<0.05；與丙泊酚2組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞遷移、侵襲能力比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞侵襲、遷移能力比較

注：與對(duì)照2組比較，*P<0.05；與丙泊酚2組比較，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞周期變化 見表3。

表3 各組不同細(xì)胞周期所占比例比較

注：與對(duì)照2組比較，*P<0.05；與丙泊酚2組比較，#P<0.05。

2.4 各組Cyclin D1、NF-κB蛋白表達(dá)比較 見表4。

表4 各組Cyclin D1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照2組比較，*P<0.05；與丙泊酚2組比較，#P<0.05。

3 討論

丙泊酚是臨床廣泛應(yīng)用的靜脈麻醉藥物，其起效迅速，可用于麻醉誘導(dǎo)及麻醉維持[5～7]。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚用于神經(jīng)外科手術(shù)可起到一定腦組織保護(hù)作用[8,9]，但過量使用可能導(dǎo)致心臟或呼吸抑制[5,10,11]。七氟醚主要通過呼吸道及肺部代謝，無刺激性，臨床常用于呼吸麻醉誘導(dǎo)。有研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚在體外可抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移[3]。因此，麻醉方法或麻醉藥物可能對(duì)腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存和轉(zhuǎn)歸有一定影響[4]，采用對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲有一定抑制作用的麻醉藥物或麻醉方法，有可能減少腫瘤細(xì)胞在手術(shù)期間轉(zhuǎn)移、播散，從而達(dá)到降低腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移概率。

本研究直接從頸內(nèi)靜脈采集靜脈血，制備丙泊酚、七氟醚含藥血清，在體外干預(yù)SHG-44細(xì)胞，比較接近麻醉藥物在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生的藥理效應(yīng)[12，13]。本研究通過細(xì)胞增殖、遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，七氟醚2組可明顯抑制SHG-44細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，而丙泊酚2組與對(duì)照2組SHG-44細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，對(duì)同樣可以使用七氟醚、丙泊酚麻醉時(shí)，手術(shù)麻醉應(yīng)優(yōu)先考慮七氟醚，以減少膠質(zhì)瘤術(shù)中播散的風(fēng)險(xiǎn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，七氟醚2組G0/G1期SHG-44細(xì)胞所占比例明顯高于對(duì)照2組和丙泊酚2組，S期、G2/S期細(xì)胞所占比例明顯低于對(duì)照2組和丙泊酚2組，而對(duì)照2組與丙泊酚2組G0/G1期、S期、G2/S期細(xì)胞所占比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示七氟醚具有一定細(xì)胞周期阻滯作用，可抑制SHG-44細(xì)胞進(jìn)一步分裂增殖。

Cylin D1屬于細(xì)胞周期蛋白家族成員之一，主要功能是促進(jìn)細(xì)胞增殖。Cyclin D1通過結(jié)合并激活G1時(shí)期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白從其所結(jié)合的E2F轉(zhuǎn)錄因子上解離，E2F轉(zhuǎn)錄因子起始轉(zhuǎn)錄細(xì)胞周期相關(guān)基因，從而推動(dòng)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可由DNA損傷在內(nèi)的多種因素激活上調(diào)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長具有重要作用，在多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞中均可見NF-κB激活上調(diào)。研究表明，NF-κB在細(xì)胞DNA損傷中具有抵抗修復(fù)的作用[14，15]。本研究結(jié)果顯示，七氟醚2組Cylin D1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于對(duì)照2組和丙泊酚2組，而對(duì)照2組與丙泊酚2組Cylin D1、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，七氟醚可能通過下調(diào)Cylin D1、NF-κB蛋白表達(dá)來抑制SHG-44細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，七氟醚含藥血清可抑制SHG-44細(xì)胞的生物學(xué)行為，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)Cyclin D1、NF-κB表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)同樣可以使用七氟醚、丙泊酚麻醉時(shí)，手術(shù)麻醉應(yīng)優(yōu)先考慮七氟醚，以減少膠質(zhì)瘤術(shù)中播散的風(fēng)險(xiǎn)。