黃芪赤風(fēng)湯對大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的治療作用

谷雨龍，朱丹，柏冬，張立石

(1 中央民族大學(xué)民族醫(yī)藥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100081；2 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯娜硇宰陨砻庖咝约膊。瑢儆谥嗅t(yī)“痹證”范疇。黃芪赤風(fēng)湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，由黃芪、赤芍和防風(fēng)組成，“此方治諸病皆效者，能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀，氣通血活，何患疾病不除”。基于文獻(xiàn)多元分析的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎用藥規(guī)律研究認(rèn)為，黃芪是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎骨破壞使用頻次最高的單味藥[1，2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪的有效成分包括黃芪總皂苷、黃芪總黃酮，黃芪總皂苷可抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖，黃芪總黃酮可通過免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)揮關(guān)節(jié)保護(hù)作用[3]；防風(fēng)色原酮是防風(fēng)的有效成分之一，具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用[4，5]；赤芍單萜苷是赤芍的有效成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用[6，7]。基于其有效成分的藥理作用，我們推測黃芪赤風(fēng)湯可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。2017年12月～2018年7月，我們觀察了黃芪赤風(fēng)湯對早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用，旨在為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，SPF級，6周齡，體質(zhì)量(180±10)g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物許可證號：SCXK(京)2014-013。黃芪赤風(fēng)湯(黃芪60 g、赤芍3 g、防風(fēng)3 g)，經(jīng)提取、分離、純化，得到黃芪總皂苷與總黃酮、赤芍單萜苷、防風(fēng)色原酮，各成分按原藥材比例混合均勻，最后經(jīng)真空干燥，所得干燥物即為黃芪赤風(fēng)湯提取物，由中央民族大學(xué)藥學(xué)院自制。甲氨蝶呤(MTX)，上海上藥信誼藥廠有限公司。DNM-9602G型酶標(biāo)儀、DNX-9620A洗板機(jī)，北京普朗新技術(shù)有限公司。牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex公司；弗氏完全佐劑，美國Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-1β、IFN-γ ELISA試劑盒，北京德易臨床檢驗(yàn)所有限公司；大鼠瓜氨酸化組蛋白H3 ELISA試劑盒，美國Epigentek公司。

1.2 動物分組處理 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為對照組、模型組、MTX組及黃芪赤風(fēng)湯低、中、高劑量組，每組10只。模型組、MTX組及黃芪赤風(fēng)湯低、中、高劑量組參照文獻(xiàn)[8]建立膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型，對照組不建模，正常喂飼。CIA模型制備：取適量2 mg/mL牛Ⅱ型膠原溶液逐滴加入等體積弗氏完全佐劑中，使牛Ⅱ型膠原終濃度為1 mg/mL，冰浴中用勻漿器充分乳化；取乳化后的混合物0.2 mL，尾根部皮內(nèi)注射；注射第10天，取乳化后的混合物0.1 mL，再次尾根部皮內(nèi)注射。首次皮內(nèi)注射次日，MTX組給予MTX 0.3 mg/kg灌胃，黃芪赤風(fēng)湯低、中、高劑量組按人和動物間體表面積折算的等效劑量比值分別給予含黃芪赤風(fēng)湯生藥量7.7、23.1、69.3 g/kg灌胃，對照組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。MTX組每周一、四灌胃1次，共灌胃6次[9]；其余各組每日灌胃1次，連續(xù)灌胃21天。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評分和踝關(guān)節(jié)直徑 模型組、MTX組及黃芪赤風(fēng)湯低、中、高劑量組分別于首次皮內(nèi)注射第13、16、19、21天，對照組同時間，按5級評分法進(jìn)行雙后踝關(guān)節(jié)AI評分，單側(cè)后踝關(guān)節(jié)最大計4分，雙側(cè)最大計8分。AI評分標(biāo)準(zhǔn)：無關(guān)節(jié)炎計0分；小趾關(guān)節(jié)輕度腫脹計1分；小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹計2分；踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹計3分；包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部關(guān)節(jié)腫脹計4分。模型組、MTX組及黃芪赤風(fēng)湯低、中、高劑量組分別于首次皮內(nèi)注射第0、7、13、16、19、21天，對照組同時間，用游標(biāo)卡尺測量雙后踝關(guān)節(jié)直徑。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量 各組末次灌胃24 h，3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，腹主動脈取血6 mL，3 000 r/min離心20 min，留取上清液，-80 ℃冰箱保存。采用DNM-9602G型酶標(biāo)儀、ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.3.3 關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量 腹主動脈取血后，雙后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)注入無菌生理鹽水0.1 mL，反復(fù)抽吸混勻，抽盡膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)液體，3 000 r/min離心20 min，取上清液，- 80 ℃冰箱保存[10]。采用DNM-9602G型酶標(biāo)儀、ELISA法檢測膝關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化組蛋白H3。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間AI評分和雙后踝關(guān)節(jié)直徑比較 見表1、2。

表1 各組不同時間AI評分比較(分，

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MTX組比較，△P<0.05；與同組第13天比較，▼P<0.05。

表2 各組不同時間雙后踝關(guān)節(jié)直徑比較

注：與對照組同側(cè)比較，*P<0.05；與模型組同側(cè)比較，#P<0.05；與MTX組同側(cè)比較，△P<0.05；與同組同側(cè)第0天比較，▼P<0.05；與同組同側(cè)第7天比較，◇P<0.05；與同組同側(cè)第13天比較，◆P<0.05。

2.2 各組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量比較 見表3。

表3 各組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與MTX組比較，△P<0.05；與黃芪赤風(fēng)湯低劑量組比較，▲P<0.05；與黃芪赤風(fēng)湯中劑量組比較，▽P<0.05。

3 討論

目前，我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病率為0.32%～0.36%，總患病例數(shù)逾500萬人。由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情進(jìn)程長且易反復(fù)，初期診斷困難，關(guān)節(jié)損傷后難以修復(fù)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，甚至殘疾。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病因仍不明確，一般認(rèn)為與遺傳、環(huán)境、感染等因素密切相關(guān)。中醫(yī)認(rèn)為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是以虛實(shí)夾雜為主要表現(xiàn)的虛損性疾病，根據(jù)其臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)“痹證”范疇。《素問·痹論》云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。其風(fēng)氣勝者為行痹，寒氣勝者為痛痹，濕氣勝者為著痹也。”故類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病機(jī)是素體本虛，正氣不足，外感風(fēng)寒濕邪，痹阻脈絡(luò)，流注關(guān)節(jié)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證。

黃芪赤風(fēng)湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯》，由黃芪二兩、赤芍和防風(fēng)各一錢組成?！按朔街沃T病皆效者，能使周身之氣通而不滯，血活而不瘀，氣通血活，何患疾病不除”，方中黃芪補(bǔ)益肺氣，赤芍清熱涼血、活血祛瘀，防風(fēng)祛風(fēng)解表、勝濕解痙止痛。以本方為基礎(chǔ)配伍聯(lián)合其他中藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎已有臨床報道[11]。本研究經(jīng)提取、分離、純化，得到黃芪總皂苷與總黃酮、赤芍單萜苷、防風(fēng)色原酮，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，各成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等作用。因此推測，黃芪赤風(fēng)湯可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。

CIA動物模型是觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的最佳動物模型，其臨床表現(xiàn)、免疫學(xué)和免疫機(jī)制等均與人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎接近。因此，本課題組選用CIA動物模型作為載體，研究黃芪赤風(fēng)湯提取物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用。研究證實(shí)，細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ產(chǎn)生的免疫損害是導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎慢性炎癥的關(guān)鍵因素[12]。TNF-α作為促炎性細(xì)胞因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，可參與內(nèi)皮細(xì)胞的激活、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)、白細(xì)胞的聚集、破骨細(xì)胞的活化與軟骨的破壞等，繼而導(dǎo)致炎性反應(yīng)持續(xù)發(fā)生和軟骨或骨漸進(jìn)性破壞。IL-1β是最強(qiáng)的骨吸收劑，可直接增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨侵蝕吸收能力，導(dǎo)致骨的破壞；局部IL-1β水平升高可抑制軟骨修復(fù)，并與TNF-α具有協(xié)同增強(qiáng)作用。IFN-γ在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中合成，是一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)促發(fā)炎癥[13]。早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清及關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化蛋白含量明顯升高，是一個敏感的生物標(biāo)志物[14]。瓜氨酸化蛋白主要包括瓜氨酸化纖維蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化組蛋白、環(huán)瓜氨酸肽等，是由肽基精氨酸經(jīng)肽酰精氨酸亞氨酶催化脫去亞氨基轉(zhuǎn)變而成[15]。有文獻(xiàn)報道，瓜氨酸化組蛋白是免疫應(yīng)答的抗原靶標(biāo)，可啟動類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎癥的起始和傳播[16，17]。

本研究結(jié)果顯示，CIA動物模型建立第13天，模型組AI評分和雙后踝關(guān)節(jié)直徑較對照組明顯增加，表明成功建立了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型。在AI評分方面，與模型組比較，MTX組各時間點(diǎn)AI評分均明顯降低，黃芪赤風(fēng)湯低劑量組建模第16天AI評分開始明顯降低，黃芪赤風(fēng)湯中、高劑量組AI評分降低不明顯；在后踝關(guān)節(jié)直徑方面，與模型組比較，MTX組建模第13天雙后踝關(guān)節(jié)直徑明顯降低，黃芪赤風(fēng)湯低劑量組建模第16天雙后踝關(guān)節(jié)直徑開始明顯降低，而黃芪赤風(fēng)湯中、高劑量組雙后踝關(guān)節(jié)直徑降低不明顯。末次灌胃24 h，模型組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及關(guān)節(jié)滑液瓜氨酸化組蛋白H3含量均明顯高于對照組，MTX組和黃芪赤風(fēng)湯低劑量組上述指標(biāo)較模型組明顯降低。黃芪赤風(fēng)湯中劑量組血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及黃芪赤風(fēng)湯高劑量組血清TNF-α、IL-1β含量均高于模型組，可能與黃芪的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，大劑量應(yīng)用可增強(qiáng)大鼠免疫功能，導(dǎo)致上述指標(biāo)明顯升高。

綜上所述，黃芪赤風(fēng)湯可用于治療大鼠CIA，這為其臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。