復發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤患者外周血中PD-1的表達及意義

翁珊珊，吳圣豪，蔡小平，鄭翠蘋

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種B細胞惡性克隆性腫瘤，其典型特性為異常的漿細胞分泌并產(chǎn)生單克隆免疫球蛋白，導致骨髓（BM）造血衰竭，最終出現(xiàn)貧血、溶骨性病變、高鈣血癥、高黏滯血癥、腎功能衰竭和反復的細菌感染等[1]。MM作為免疫效應細胞的惡性腫瘤，存在體液免疫和細胞免疫的雙重缺陷與失調(diào)，能使之逃避機體的免疫監(jiān)視和免疫殺傷功能。造成MM免疫功能紊亂的一個關鍵因素是程序性死亡-1（PD-1）。PD-1在各類免疫細胞的活化和耐受中起了關鍵作用，其存在兩種配體，即PD-L1和PD-L2。大量研究證明，PD-1與其配體結合，能產(chǎn)生并傳遞負性調(diào)控信號，誘導腫瘤抗原特異性T細胞的凋亡和免疫無能，促使腫瘤的免疫監(jiān)視與免疫逃逸[2]。本研究觀察PD-1在復發(fā)難治性多發(fā)性骨髓瘤（RRMM）患者外周血中的表達，分析其在免疫功能中的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2016年10月浙江省溫州市中心醫(yī)院收治的RRMM患者28例，初診時均符合RRMM的診斷標準，臨床資料完整，且完成至少2個周期治療。其中男16例，女12例；中位年齡67歲；IgG型16例，IgA型7例，IgD型5例；Durie-Salmon疾病分期：Ⅱ期10例，Ⅲ期18例；復發(fā)19例，難治9例。伴腎功能不全18例?；颊呒韧?jīng)包括硼替佐米、沙利度胺在內(nèi)的不同方案的治療，中位化療數(shù)6（3～16）次。另選同期在本院健康體檢者14例作為對照組，均無感染、腫瘤及自身免疫性疾等病史，其中男8例，女6例；中位年齡50歲。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 治療方法 28例患者均采用來那度胺聯(lián)合地塞米松的治療方案（LD），28 d為1個療程，來那度胺10～25 mg/d，于d1～21給藥，休息 7 d。初始劑量根據(jù)患者的腎功能、年齡及骨髓造血情況來決定。地塞米松 20 mg/d，于療程 d1、8、15、22 給藥。肝、腎功能不良或不能耐受的患者應調(diào)整劑量。服用來那度胺期間常規(guī)使用腸溶阿司匹林片100 mg，qd以預防深靜脈血栓形成。隨訪至2017年8月。

1.3 療效評價及實驗方法 患者在完成2個周期治療后評價療效，比較治療前后PD-1表達的差異。療效參照EBMT/ABMTR標準[3]，分為嚴格完全緩解（Scr）、完全緩解（CR）、非常好的部分緩解（VGPR）、部分緩解（PR）、疾病穩(wěn)定（SD）、疾病進展（PD）。抽取各實驗對象清晨空腹外周血，EDTA抗凝。取標本各10l進行溶血，得到分離的淋巴細胞，PBS洗滌 1次，分別加入不同熒光標記抗人 CD4/CD8、CD45RA、CD27和PD-1表面分子抗體，振蕩器震蕩均勻，室溫避光染色20 min，離心5 min棄上清液，得到的細胞用PBS液洗滌2次，震蕩均勻，室溫避光保存。流式細胞儀設置獲取細胞數(shù)不少于 50 000個，并用flowjo流式分析軟件對結果進行分析，得出PD-1的表達。

1.4 統(tǒng)計方法 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PD-1的表達水平 3組CD4+、CD8+T細胞表面PD-1水平差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜ 0.05），RRMM患者CD4+、CD8+T細胞表面PD-1表達水平均高于健康組，治療后RRMM患者CD4+T、CD8+T細胞表面PD-1表達水平亦均高于健康組（均P＜0.05）。3組外周血中CD4+TPD-1表達水平高于CD8+T（均 P＜ 0.05）。見表 1。

2.2 不同臨床分期RRMM外周血CD4+T和CD8+TPD-1的比較 III期RRMM患者治療前后CD4+、CD8+T細胞中PD-1表達水平均高于II期（均P＜0.05）。見表 2。

2.3 與臨床療效的相關性分析 Scr、CR、VGPR為9例，PR、SD為11例，PD為8例。與治療前比較，達到Scr、CR、VGPR的MM患者CD4+T、CD8+T PD-1表達明顯下降；而PD者PD-1表達也下降，但不明顯。見表3。

表1 研究對象外周血CD4+、CD8+T細胞PD-1表達量

表2 RRMM治療前后疾病分期中CD4+T和CD8+T PD-1表達

表3 復發(fā)難治組治療前后CD4+T、CD8+T PD-1的表達

3 討論

MM是血液系統(tǒng)第3大常見惡性腫瘤，盡管新化療藥物的應用及alloSCT等治療手段使MM的緩解率不斷提高，但其初診后5年生存率僅為44%，終將復發(fā)耐藥甚至進展[4]，對于復發(fā)難治耐藥的患者，目前尚無療效滿意的治療藥物。以往實驗顯示，在不同的實體腫瘤和大多數(shù)血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的外周血細胞上PD-1可較高水平的表達，且與腫瘤的不良預后相關。這提示 PD-1可能參與抗腫瘤的免疫應答。PD-1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，在活化的T及B細胞、單核細胞、NK細胞以及間充質(zhì)干細胞中高表達[5]，在T細胞功能紊亂時持續(xù)性表達，作為抑制性信號在腫瘤發(fā)病過程中限制 T細胞的免疫效應。PD-1還可影響T細胞的分化，抑制各種炎性介質(zhì)的釋放[6]，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在密切關系。

本研究應用流式細胞術發(fā)現(xiàn)，RRMM患者外周血中CD4+和CD8+T細胞表面PD-1的表達均增高，且CD4+T細胞PD-1的表達約是CD8+T細胞的2倍，健康組表達少量PD-1。目前尚不清楚正常人T細胞中PD-1表達的意義，推測可能與機體免疫耐受的維持有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD-1的表達與MM分期有關，經(jīng)有效治療后PD-1的表達下降，提示PD-1的表達與骨髓瘤臨床分期、疾病嚴重程度相關，高表達PD-1的MM患者具有臨床進展跡象。而治療后疾病未緩解甚至疾病進展者 PD-1的表達無明顯下降甚至上升，即PD-1的表達水平與療效有相關性，但需進一步研究證實。

作為新型免疫抑制劑，抗PD-1抗體已用于各種腫瘤的治療，在治療RRMM中療效顯著，其中CR 17%，PR70%[7]。Nivolumab用于黑色素瘤的治療效果也很驚人，據(jù)報道黑色素瘤患者客觀緩解率大于30%[8]。另一項Ⅰ/Ⅱ期非小肺癌臨床研究結果顯示，用PD-1抗體治療的患者有效率為45%，中位無進展生存期為10個月；而用順鉑加吉西他濱治療的患者有效率為28%，中位無進展生存期為6個月[9]。早前Iwai的研究團隊用骨髓瘤小鼠模型證明了抑制PD-1/PD-L1信號通路能抑制MM瘤細胞生長，并設想PD-1可用于MM的治療中。Tamura等[10]的研究也證明，應用抗PD-1單克隆抗體，能夠增強MM對自體細胞的溶解活性。

綜上所述，PD-1/PD-L1在免疫抑制中具有重要作用，阻斷此途徑可促進抗腫瘤免疫應答，為MM免疫逃逸機制及其靶向治療提供重要的理論及實驗依據(jù)。PD-1治療相關的毒副作用非常小，患者能夠耐受，可作為替代和可持續(xù)選擇的新型治療方式。但目前缺乏評估其在早期疾病和維持應用中的試驗，有待進一步研究。