miR-45-5p在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其生物學(xué)特性

魯楊，王金秋，郭宇，張樂鳴

作者單位： 315211寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院（魯楊、王金秋）；寧波市第一醫(yī)院（郭宇、張樂鳴）

結(jié)直腸癌（CRC）是常見的惡性腫瘤，占全球惡性腫瘤死亡原因的第3位[1]。CRC的發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素過程，而對(duì)于其發(fā)病機(jī)制目前尚未有一個(gè)明確的結(jié)果[2]。微小RNA（miRNAs）是一類長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其廣泛存在于真核生物中[3]。研究證明miRNA在細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲等生物學(xué)活動(dòng)中都發(fā)揮了重要的作用，是腫瘤潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)[4]。miR-455-5p位于第6條染色體上，它在間變性大細(xì)胞淋巴瘤[5]、食管癌[6]及胃癌[7]等呈現(xiàn)低表達(dá)。Yang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-455-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中通過作用于靶基因 galectin-9起著癌基因的作用。但由于該研究入組的組織標(biāo)本只包含結(jié)腸癌組織，缺乏組織學(xué)方面的驗(yàn)證，并且只在一株結(jié)腸癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，不夠全面，也并未全面探討miR-455-5p在CRC中的作用。本研究擬探討miR-455-5p在CRC的表達(dá)及其生物學(xué)特性，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

1.1.1 組織標(biāo)本 收集2016年3―7月寧波市第一醫(yī)院收治的行手術(shù)治療的CRC患者的組織標(biāo)本40例，分別切取CRC組織標(biāo)本與其癌旁正常黏膜組織（≥10 cm），其中結(jié)腸癌標(biāo)本19例，直腸癌標(biāo)本21例。40例患者中男24例，女16例；年齡43～85歲，≥60歲28例，＜60歲12例，平均（65±11）歲；采用TNM分期法，Ⅰ期6例，Ⅱ期17例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例；病理分化程度為低分化7例，中低分化5例，中分化28例。所有患者術(shù)前未行放、化療或免疫治療，無其他腫瘤病史，術(shù)后病理檢查均由2名病理醫(yī)師診斷。組織標(biāo)本離體后立刻放入RNA保存液中，于―80℃冰箱中保存。所有過程告知患者并與患者簽署知情同意，此研究經(jīng)寧波市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞株 人結(jié)腸癌 SW-480、HCT-116及HT-29細(xì)胞株，均購(gòu)買于上海諾百公司。

1.2 主要試劑 攜帶有miR-455-5p-mimics的重組質(zhì)粒和 miR-455-5p-inhibitor的重組質(zhì)粒及對(duì)照miR-455-5p-mimicscontrol和miR-455-5p-inhibitorcontrol由上海吉瑪公司合成。反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自南京金斯瑞生物科技公司。轉(zhuǎn)染所需Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，PBS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Rnase Inhibitor購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自中國(guó)Thermo公司。AnnexinⅤ-PE/7-AAD凋亡試劑盒購(gòu)自凱基生物公司。鼠抗人 Brdu單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。山羊抗小鼠IgG熒光二抗購(gòu)自美國(guó)美國(guó)AAT Bioquest公司。劃痕試驗(yàn)所需Protein Marker（DM111-01）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 組織標(biāo)本RNA提取 將組織標(biāo)本在液氮中研磨，采用Trizol法提取組織總RNA，紫外線分光光度計(jì) NanoDrop ND-1000（NanoDrop，Wilmington，DE）用于評(píng)估RNA的濃度和純度。所有RNA樣品置于―80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選擇細(xì)胞狀態(tài)良好的3株CRC細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。采用Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染3株細(xì)胞株，選取1、2和2l的NegativecontrolFAM轉(zhuǎn)染3株細(xì)胞，分別用PBS清洗，加入胰蛋白酶清洗消化，離心，棄上清液，再重復(fù)上述過程2次，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.3.3 miR-455-5p的定量分析 按照試劑盒說明書對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA。收集的細(xì)胞沉淀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄到cDNA后，用sybr染料法進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè) miR-455-5p基因的表達(dá)水平。檢測(cè)miRNA表達(dá)量的引物序列見表1。

1.3.4 Brdu增殖檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC 及 inhibitor-NC 48h后的SW480、HT-29、HTC-116細(xì)胞株收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。在24孔板中添加培養(yǎng)基并加入生長(zhǎng)細(xì)胞的蓋玻片，將制備好的細(xì)胞懸液分別以2×104接種到24孔板中。加Brdu孵育，濃度10mol/L，時(shí)間1h。用PBS清洗3次，加入1%BSA/PBS稀釋Brdu抗體，37℃，2 h或者4℃過夜。用PBS洗5min，重復(fù)3次。再次加入1%BSA/PBS稀釋熒光二抗，37℃下避光孵育45 min。用PBS洗5min，重復(fù) 3次。用DAPI或 hoechst染核（1：10000稀釋），室溫避光10 min。用PBS洗5 min，重復(fù)2次。熒光顯微鏡觀察熒光比例。

1.3.5 凋亡檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC 及 nhibitor-NC 48 h后的CRC細(xì)胞接種至細(xì)菌培養(yǎng)板中，培養(yǎng)條件改為2%FBS的完全培養(yǎng)基，過夜處理第2天，將細(xì)胞重懸于100l Binding Buffer中，加入5l 7-AAD染液。輕輕混勻，室溫、避光、反應(yīng)5～15min；再加入400lBindingBuffer、1lAnnexinV-PE混勻；室溫、避光、反應(yīng)5～15 min，最后在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)。AnnexinV-PE熒光信號(hào)呈橙紅色；激發(fā)波長(zhǎng)546nm，發(fā)射波長(zhǎng)647nm，觀察7-AAD熒光信號(hào)呈紅色，并統(tǒng)計(jì)檢測(cè)結(jié)果。

1.3.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染 miR-455-5p-inhibitor、miR-455-5P-mimics、mimics-NC及inhibitor-NC48h后的HT-29細(xì)胞收集后制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)備用。用marker筆在12孔板背后，均勻得劃?rùn)M線。用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基。放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)。按0、6、12及24h取樣，拍照。使用ipwin32軟件進(jìn)行面積和長(zhǎng)度的分析計(jì)算寬度值。通過細(xì)胞間距比例進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

表1 檢測(cè)miRNA表達(dá)量的引物序列

2.1 miR-455-5p在組織中的表達(dá)情況及臨床病理因素分析 用QPCR方法檢測(cè)40對(duì)配對(duì)CRC組織中的miR-455-5p的表達(dá)，miR-455-5p在CRC癌組織中相對(duì)表達(dá)量為（0.59±0.34），在相對(duì)應(yīng)的癌旁組織中相對(duì)表達(dá)量為（2.45±1.60），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.46，P＜ 0.01）。

miR-455-5p的表達(dá)量與患者的性別、年齡、腫瘤部位，有無淋巴轉(zhuǎn)移、病理類型、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無明顯關(guān)系（均P＞0.05），與腫瘤的分化程度有關(guān)（P＜0.05），見表2。

2.2 Brdu檢測(cè)miR-455-5p對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染 miR-455-5p mimics的細(xì)胞作為陽(yáng)性組，轉(zhuǎn)染miR-455-5p-inhibitor的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-455-5p-inhibitor后3株CRC細(xì)胞（HT-29、HCT-116、SW-480）的增殖百分比分別為40%、60%和53%；而過表達(dá)miR-455-5p-mimics后的 CRC細(xì)胞增殖率受到抑制，其中 HT-29、HCT-116及 SW-480 3株細(xì)胞的增殖百分比分別為20%、23%和21%，3株細(xì)胞的增殖活性均減弱。陽(yáng)性組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組增殖率變化趨勢(shì)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果 FCM（A-F）顯示轉(zhuǎn)染了 miR-455-5p-mimics的 CRC細(xì)胞株（HT-29、HCT-116）的凋亡率分別為 41.43%和48.3%，較miR-455-5p-mimics control組細(xì)胞凋亡率（34.82%和39.3%）明顯增加（均P＜0.05）；而在SW-480細(xì)胞株中，轉(zhuǎn)染miR-455-5p-5p-mimics凋亡率為11.3%，較轉(zhuǎn)染miR-455-5p-mimicscontrol組的凋亡率（11.81%）無明顯變化。見封二彩圖3。

魯楊，王金秋，郭宇，等.miR-45-5p在結(jié)直腸癌的表達(dá)及其生物學(xué)特性（見正文第1572頁(yè)）

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-455-5p對(duì)HT-29細(xì)胞遷移能力的影響 對(duì)HT-29細(xì)胞劃痕處理后，間隔6 h連續(xù)觀察細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)染miR-455-5pinhibitor組劃痕24h，細(xì)胞已基本完全覆蓋劃痕區(qū)域。見封二彩圖4。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)：miR-455-5p抑制HT-29細(xì)胞株遷移

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。由于它們?cè)谀[瘤中起著癌基因或抑癌基因的作用[9]，如今已經(jīng)成為了腫瘤研究的熱點(diǎn)。隨著miRNA在腫瘤研究方面的不斷深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)miRNA與某些抗腫瘤藥物療效密切相關(guān)，并參與腫瘤對(duì)藥物敏感性的調(diào)控，這也預(yù)示其在臨床上具有指導(dǎo)作用。研究證實(shí)，miRNA在腫瘤早期診斷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[10]。miR-21作為首個(gè)在人體體液中發(fā)現(xiàn)的miRNA，Toiyama等[11]通過對(duì)比分析186例腸癌組織、43例高級(jí)別腺瘤及53例對(duì)照組發(fā)現(xiàn)，血清miR-21表達(dá)水平隨臨床分期呈階梯狀升高，且其靈敏度及特異度都很高，認(rèn)為其可作為CRC的篩查手段。該研究還發(fā)現(xiàn)miR-21表達(dá)水平可作為影響CRC患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。Slaby等[12]發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中miR-145表達(dá)水平明顯下調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤體積和TNM分期有臨床相關(guān)性，認(rèn)為miR-145作為抑癌因子在腸癌發(fā)展過程中起到重要作用，尤其在腺瘤惡變?yōu)橄侔┻^程中尤為顯著。miRNA與CRC的相互關(guān)系，為CRC的預(yù)防、診斷和治療提供了新的思路。

miR-455-5p作為miR-455家族中的一員，研究已證明其在腫瘤中起著重要作用。Shoshan等[13]在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn) miR-455-5p負(fù)調(diào)控腫瘤抑制因子CPEB1基因，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。Hudson等[14]證明miR-455-5p在甲狀腺髓樣癌呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，其在甲狀腺髓樣癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在其他腫瘤，如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤[15]、胸腺上皮腫瘤[16]中也進(jìn)一步證明miR-455-5p起著抑癌基因的作用，在腫瘤的發(fā)生過程中起著重要的生物學(xué)作用。

表2 CRC患者的臨床病理因素

miRNAs表達(dá)的改變可以導(dǎo)致遺傳信息表達(dá)的改變，從而導(dǎo)致相應(yīng)的病理生理狀態(tài)，而處于一定病理生理狀態(tài)的組織常伴有特定的miRNAs表達(dá)[17]。在本研究中，筆者首先證明了miR-455-5p在CRC患者癌組織中表達(dá)顯著低于癌旁組織；通過miR-455-5p與CRC患者臨床病理因素進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR-455-5p的表達(dá)量與腫瘤的分化程度有關(guān)。這一結(jié)果也證明了 miR-455-5p可能起著抑癌基因的作用，參與CRC的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究通過轉(zhuǎn)染CRC細(xì)胞，通過Brdu檢測(cè)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、劃痕實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)miR-455-5p可影響CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)，其與腫瘤細(xì)胞增殖活性有關(guān)，也與腫瘤細(xì)胞凋亡活性的增強(qiáng)密切相關(guān)，由此證實(shí)miR-455-5p在CRC中可以作為一個(gè)抑癌基因來發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促凋亡的作用。而本研究的結(jié)果也與miR-455-5p在其他腫瘤的研究一致[13-16]。

目前miR-455-5p在CRC的研究中機(jī)制尚不清楚，Yang等[8]在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-455-5p的相對(duì)表達(dá)較癌旁組織是升高的，并且進(jìn)一步在HT-29細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)其抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，起著一個(gè)癌基因的作用，而這一結(jié)果與本研究的結(jié)果存在差異。筆者認(rèn)為，兩個(gè)研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法及研究目的上存在不同，Yang等[8]的研究是采用CCK方法進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，且研究miR-455-5p與galectin-9之間的關(guān)系；而本研究是采用Brdu方法進(jìn)行檢測(cè)，另外該研究在組織樣本量的檢測(cè)中只有10例，且均為結(jié)腸癌組織，較本研究數(shù)量上存在差距，并且本研究入組的標(biāo)本組織種包含了結(jié)腸癌組織和直腸癌組織；在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中Yang等[8]的研究也只是在一種細(xì)胞株中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可能存在偏倚，所以兩個(gè)研究結(jié)果出現(xiàn)了差異。本研究與Yang等[8]的研究結(jié)果的差異，也提示miR-455-5p在CRC中可能存在異質(zhì)性，并不像其在其他腫瘤中只表現(xiàn)抑癌作用，可能起著癌基因和抑癌基因的作用，對(duì)于以后通過miR-455-5p治療CRC，其治療方式可能不同于其他腫瘤。因此對(duì)于miR-455-5p在CRC中的研究還將繼續(xù)。

綜上所述，miR-455-5p在CRC組織中低表達(dá)，具有類似抑癌基因的作用，降低了CRC細(xì)胞的增殖、遷移能力，為CRC的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，但是miR-455-5p是如何在CRC細(xì)胞中發(fā)揮作用，以及與其所針對(duì)的下游靶基因所介導(dǎo)的通路尚不明確，同時(shí)考慮到本研究中所搜集的標(biāo)本量較少，在樣本數(shù)據(jù)與臨床病理分析中得到的結(jié)論可能缺乏一定的科學(xué)性。