高效液相色譜法測(cè)定蒲地藍(lán)消炎顆粒中黃芩苷的含量

朱育紅，潘康鎖，林 濤，蘇 敏，晏永新，楊彥平

(1.陜西省獸藥監(jiān)測(cè)所，西安710016；2.西安雨田農(nóng)業(yè)科技有限公司，西安710075；3.西安國(guó)聯(lián)質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，西安?倓710105；4.江西新世紀(jì)民星動(dòng)物保健品有限公司，南昌330096)

蒲地藍(lán)消炎顆粒是運(yùn)用中獸醫(yī)傳統(tǒng)理論，在中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《部頒標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(cè)所載“蒲地藍(lán)消炎片”的基礎(chǔ)上研制的中獸藥三類新藥。處方由黃芩、蒲公英、板藍(lán)根和苦地丁四味藥材組成。該藥是采用提取精制的方法制成的中藥顆粒劑，具有清熱解毒，抗炎消腫之效，用于雞傳染性支氣管炎誘發(fā)的咳喘證。收載在中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《部頒標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(cè)的蒲地藍(lán)消炎片原標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定方法。為更好的控制蒲地藍(lán)消炎顆粒的質(zhì)量，參考文獻(xiàn)方法，研究建立了采用反相高效液相法測(cè)定蒲地藍(lán)消炎顆粒中黃芩苷的含量測(cè)定方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC20高效液相色譜儀；安捷倫1100型高效液相色譜儀；色譜柱Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；電子天平(型號(hào)BP211D)購(gòu)自德國(guó)塞托里斯公司。

1.2 試藥與試劑 黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)為110715-201117，標(biāo)識(shí)含量為91.7%)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；蒲地藍(lán)消炎顆粒樣品(每1 g相當(dāng)于原生藥1.5 g)三批，批號(hào)分別20120203、20120204、20120205，來(lái)源于江西新世紀(jì)民星動(dòng)物保健品有限公司；甲醇為色譜醇，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-0.3%磷酸溶液(45∶55)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇少許使溶解，加50%甲醇稀釋，制成每1 mL含0.25 mg的黃芩苷對(duì)照品貯備液(實(shí)際濃度為0.252 mg/mL)，精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋至刻度(實(shí)際濃度為50.4 μg/mL)，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取蒲地藍(lán)消炎顆粒適量，研細(xì)，取細(xì)粉約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方及制法制備不含黃芩的陰性制劑，取黃芩陰性制劑，按供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn) 精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果理論塔板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)算為7016，供試品色譜圖中黃芩苷峰與臨峰分離良好，分離度為3.92，陰性對(duì)照色譜在與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處無(wú)干擾峰(圖1)。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求；處方中其他成分對(duì)黃芩定量檢測(cè)無(wú)干擾，專屬性能滿足檢測(cè)要求。

(A:Radix scutellariae;B: Pudilan Anti-inflammatory Granule;C: Scutellariae Radix negative control)圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖(A、B、C分別為黃芩苷、蒲地藍(lán)消炎顆粒供試品、黃芩陰性對(duì)照)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test

2.4 線性關(guān)系考察 取黃芩苷對(duì)照品貯備液(濃度0.252 mg/mL)，分別精密吸取1、2、5、10、15 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=39.396x-2.1797，R2=0.9999(n=5)，黃芩苷在10.08～151.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收的方法，在已知含量的蒲地藍(lán)消炎顆粒中，加入一定質(zhì)量的黃芩苷對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，使其制備后在供試品中的量為其限度值的100%，共制備6份。再按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算黃芩苷的量，用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量，計(jì)算黃芩苷回收率，即得。

回收率R(100%)=(實(shí)測(cè)量-供試品中含有量)/添加量×100%

測(cè)定結(jié)果，黃芩苷的回收率在98.4%～101.4%之間，平均回收率為99.8%，RSD為1.03%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)Tab 1 Recovries of Baicalin in preparation

2.6 精密度 取供試品(批號(hào)為20120203)溶液，精密量取10 μL，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得黃芩苷峰面積RSD為1.19%，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)Tab 2 Precision test

2.7 耐用性 取同一批蒲地藍(lán)消炎顆粒(批號(hào)為20120203)樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，保持流動(dòng)相比例和流速不變，在島津LC20高效液相色譜儀和Agilent1100色譜儀上分別使用Kromasil 100-5-C18 (5 μm，250 mm×4.6 mm)柱和Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 um)色譜柱，于20 ℃，30 ℃，40 ℃條件下進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性，結(jié)果表明該方法能夠耐受不同液相色譜儀，色譜柱，柱溫等因素的小范圍變化，測(cè)得蒲地藍(lán)消炎顆粒中黃芩苷的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 耐用性試驗(yàn)Tab 4 serviceability test

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)為20120203)的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，立即測(cè)定，再在2、4、6、8 h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果RSD為1.08%，表明測(cè)定值在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 3 Stability test

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批蒲地藍(lán)消炎顆粒(批號(hào)分別為20120203、20120204、20120205)分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，上機(jī)測(cè)定峰面積，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算黃芩苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果(單位：mg/g)Tab 5 Content determination results (unit：mg/g)

3 討論與結(jié)論

3.1 含量測(cè)定成分的選擇 蒲地藍(lán)消炎顆粒處方源于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部《部頒標(biāo)準(zhǔn)》第三冊(cè)“蒲地藍(lán)消炎片”，是由黃芩、蒲公英、板藍(lán)根、苦地丁四味藥材提取精制制成的中藥顆粒劑，具有清熱解毒，抗炎消腫之效，用于雞傳染性支氣管炎誘發(fā)的咳喘證。黃芩為該制劑的君藥，其主要成分為黃芩苷。黃芩苷具有顯著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、降膽固醇、抗血栓形成、緩解哮喘、瀉火解毒、止血、安胎、抗變態(tài)反應(yīng)及解痙作用，也為哺乳動(dòng)物肝臟涎酶的特異性抑制劑，具有調(diào)節(jié)某些疾病的作用，也具有較強(qiáng)的抗癌反應(yīng)生理效能，故選擇黃芩苷作為含量測(cè)定成分。采用HPLC測(cè)定蒲地藍(lán)消炎顆粒中黃芩苷的含量，操作簡(jiǎn)便，黃芩苷在10.08～151.2 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法準(zhǔn)確度、精密度、日內(nèi)穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)要求。

3.2 樣品前處理方法的選擇 黃芩苷是一種黃酮類化合物,具有顯著的生物活性。其提取分離方法主要有水浴回流提取法，水提酸沉法、醇提酸沉法、有機(jī)溶劑超聲法等方法。參考《中華人民共和國(guó)獸藥典》2015年版二部雙黃連口服液含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本試驗(yàn)采用50%甲醇作為溶劑，超聲處理20 min，結(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出蒲地藍(lán)消炎顆粒中的黃芩苷，并且陰性對(duì)照無(wú)干擾。

3.3 結(jié)論 用高效液相法測(cè)定蒲地藍(lán)消炎顆粒中黃芩苷的含量，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，靈敏度高，回收率好，可有效控制該制劑中主藥黃芩的含量。