骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨部分缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 高 巖 李 健 方世宇*

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116021）

關(guān)節(jié)軟骨中軟骨細(xì)胞較少，缺乏血供和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)，其修復(fù)能力有限。關(guān)節(jié)軟骨一旦損傷，即使是很小的面積，關(guān)節(jié)退變就不可避免。關(guān)節(jié)軟骨缺損分為軟骨全層缺損和軟骨部分缺損。組織工程學(xué)的發(fā)展提供了一種組織再生的技術(shù)手段。選擇合適來(lái)源的種子細(xì)胞和支架材料是組織工程修復(fù)中常用的研究方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可修復(fù)全層軟骨缺損，生成透明軟骨樣組織[1]。本研究用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨部分缺損。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取36只3～4個(gè)月齡的健康新西蘭兔，各體質(zhì)量約3.0 kg，購(gòu)買(mǎi)自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：胰蛋白酶粉劑、DNase粉劑，RNase粉劑，胎牛血清、二氧化碳培養(yǎng)箱，F(xiàn)D-1冷凍干燥機(jī)。

1.3 BMSCs的分離與體外培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離BMSCs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)[2]。

1.4 脫細(xì)胞關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的制備：通過(guò)冷凍干燥、化學(xué)去污劑等方法制備關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)[3]。

1.5 兔關(guān)節(jié)軟骨部分缺損模型制備：選取36只新西蘭兔，在兔雙側(cè)股骨踝關(guān)節(jié)面用直徑為5 mm的鉆孔儀鉆1～1.5 mm深的孔，以不出血為標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組和修復(fù)方法：將36只關(guān)節(jié)軟骨部分缺損模型的新西蘭兔隨機(jī)分成3組，每組各12只，每組24個(gè)膝關(guān)節(jié)樣本，分別進(jìn)行3種不同的處理：A組將BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物修復(fù)軟骨缺損；

B組單純用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)修復(fù)缺損；C組為軟骨部分缺損處不做任何處理。各組在術(shù)后4、8、12周分別處死4只新西蘭兔，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，進(jìn)行大體觀察，并通過(guò)HE染色對(duì)比觀察缺損部位的修復(fù)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：參照Wakitani 評(píng)分量表對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，并利用SPSS 13.0分析各實(shí)驗(yàn)組間是否存在顯著性差異。數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)用兔統(tǒng)計(jì)：在本研究中將36只新西蘭兔隨機(jī)分為3組，每組12只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)意外死亡，全部計(jì)入結(jié)果分析。

2.2 體外分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：密度梯度離心法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面抗原分子，發(fā)現(xiàn)BMSCs特異性高表達(dá)抗原CD44，而不表達(dá)層粘連蛋白和CD34。

2.3 脫細(xì)胞關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的制備及其特性：Massion染色結(jié)果可見(jiàn)關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中存在很多的軟骨陷窩且其周?chē)嬖诖罅康哪z原纖維。

2.4 大體觀察和組織學(xué)觀察：術(shù)后4周，A組軟骨缺損基本修復(fù)，B、C組還可見(jiàn)凹陷，與周?chē)浌墙缦弈：?；A組修復(fù)組織呈黃色，顏色偏淡，HE染色見(jiàn)少量類似幼稚軟骨細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)則，周?chē)匆?jiàn)典型的陷窩樣結(jié)構(gòu)，有較少的基質(zhì)。B、C組見(jiàn)缺損區(qū)表面的凹陷，被覆纖維組織；術(shù)后8周，B組基本完全修復(fù)，C組還見(jiàn)小凹陷。A組缺損處修復(fù)組織較前增多，顏色呈淡黃色，表面較4周時(shí)光滑，有一定彈性，與周?chē)＼浌欠纸缥聪?。A組修復(fù)組織中可見(jiàn)類幼稚軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，類軟骨陷窩出現(xiàn)，分布不均勻。B、C組缺損區(qū)為纖維組織覆蓋，呈波紋狀走行，修復(fù)組織異染，少而不均勻；12周時(shí)C組凹陷消失。A組缺損區(qū)修復(fù)組織色澤，質(zhì)地同正常關(guān)節(jié)軟骨，HE染色見(jiàn)類軟骨細(xì)胞，其形態(tài)接近正常軟骨細(xì)胞，但排列非柱狀，類軟骨陷窩增多。B、C組缺損區(qū)基本為纖維組織覆蓋，深灰白色，質(zhì)軟，與周?chē)＼浌墙M織分界清楚。兩組修復(fù)組織多為原纖維，呈波紋狀排列，未見(jiàn)軟骨陷窩形成。

2.5 組織學(xué)評(píng)分：各時(shí)間點(diǎn)各組動(dòng)物利用Wakitani 評(píng)分進(jìn)行組織學(xué)評(píng)分，A組各時(shí)間點(diǎn)的評(píng)分均優(yōu)于B、C組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。A組在不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)組織切片Wakitani評(píng)分（±s）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)組織切片Wakitani評(píng)分（±s）

組別 時(shí)間(周) 關(guān)節(jié)數(shù)(個(gè)) 細(xì)胞形態(tài) 基質(zhì)染色 表面平整 軟骨厚度 與周?chē)Y(jié)合 總分A組 4 8 1.2±0.3 1.3±0.4 1.2±0.2 1.0±0.1 1.2±0.1 6.0±1.0 8 8 0.8±0.1 0.6±0.3 0.5±0.2 0.6±0.0 0.5±0.2 3.1±0.8 12 8 0.2±0.3 0.2±0.4 0.3±0.3 0.3±0.3 0.3±0.3 1.3±1.6 B組 4 8 2.2±0.4 2.0±0.3 2.1±0.4 1.5±0.1 1.2±0.1 9.0±1.2 8 8 1.8±0.1 1.8±0.3 1.5±0.3 1.4±0.0 1.0±0.2 6.1±0.8 12 8 1.2±0.2 1.5±0.5 1.1±0.4 1.3±0.3 0.9±0.5 4.2±1.9 C組 4 8 3.2±0.5 2.8±0.4 2.8±0.5 2.0±0.1 2.2±0.1 13±1.0 8 8 2.8±0.1 2.6±0.3 2.5±0.3 1.8±0.0 1.8±0.2 11.8±0.8 12 8 2.2±0.3 2,2±0.5 2.3±0.5 1.6±0.3 1.5±0.5 9.8±1.9

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床常見(jiàn)疾病之一。軟骨的修復(fù)一直是研究的熱點(diǎn)。組織工程的發(fā)展提供了一種新的修復(fù)方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的低免疫原性和較低的抗原呈遞能力，可作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于同種異體移植。脫細(xì)胞組織基質(zhì)有良好的組織相容性，細(xì)胞吸附性以及親水性，并最大程度模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的外環(huán)境，可作為組織工程中的支架材料[4]。關(guān)節(jié)軟骨缺損分為軟骨全層缺損和軟骨部分缺損。關(guān)節(jié)軟骨部分缺損未穿破軟骨下骨，髓腔內(nèi)的血管不會(huì)影響軟骨損傷區(qū)，這不同于軟骨全層缺損。

本研究中應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨部分缺損，結(jié)果顯示可以生產(chǎn)軟骨樣組織修復(fù)缺損部位。而單獨(dú)應(yīng)用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)修復(fù)缺損部位生成的為纖維組織。表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)可被誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。相信在不久的將來(lái)，隨著關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)研究日益深入，組織工程技術(shù)將為關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)提供重要手段。