棉花WRKY22基因分離及其對(duì)黃萎病的抗性分析

雷 煜，張振楠，胡 廣，劉建芬，唐 葉，張 寧，司懷軍，吳家和

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.中國(guó)科學(xué)院 微生物研究所，北京 100101； 3.棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州大學(xué)基地，河南 鄭州 450001)

植物不能夠像動(dòng)物那樣趨利避害的自由移動(dòng)，因此，當(dāng)病原菌浸染時(shí)，其只能通過調(diào)節(jié)自身的生理生化反應(yīng)來(lái)抵抗或適應(yīng)這些變化，這些變化被稱為植物先天免疫反應(yīng)。一般認(rèn)為植物的先天免疫反應(yīng)包括2個(gè)層次或進(jìn)程，一個(gè)是由病原菌相關(guān)分子模式(PAMP)啟動(dòng)的先天免疫反應(yīng)，稱為PTI，另一個(gè)是由病原菌效應(yīng)因子(Effector)啟動(dòng)的先天免疫反應(yīng)，稱之為ETI[1-2]。當(dāng)植物先天免疫反應(yīng)時(shí)細(xì)胞內(nèi)的抗病相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生了改變(Reprogram)，而這些抗病相關(guān)基因主要是受編碼調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，其中轉(zhuǎn)錄因子主要包括WKRY、MYB、NAC、bZIP等[3]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在擬南芥中有72個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子[4]，棉花中報(bào)道的為116個(gè)[5]。WRKY蛋白一般被分為3個(gè)組群，分別為GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ，其中Group Ⅱ又被分為5個(gè)亞組，被標(biāo)為Ⅱa、b、c、d和e。WRKY蛋白含有WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，其C端含有C2H2或C2C2的鋅指結(jié)構(gòu)[5-6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通常作為植物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的重要組成因子，在植物體內(nèi)承擔(dān)著多種功能，包括植株的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)。其中對(duì)病原菌抗性反應(yīng)研究涉及多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，如在擬南芥中，WRKY7、33、3、22、48、70、72和40等直接參與抗病反應(yīng)[7-14]，這些蛋白有的參與腐生性病原菌抗性，有的參與寄生性病原菌的抗性，有的對(duì)二者都能產(chǎn)生抗性反應(yīng)[15]。這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子的抗病機(jī)制比較復(fù)雜，不斷增加的研究報(bào)道說明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過多種途徑接受抗病信號(hào)，從而調(diào)控下游抗病靶基因的表達(dá)。

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，屬于人們種植的主要作物之一[16]。棉花纖維是紡織工業(yè)的重要原料，是支撐紡織工業(yè)發(fā)展和人們生活的基礎(chǔ)；同時(shí)棉籽油是食品和化工用油的主要來(lái)源之一，棉籽粕是一種牛羊等反芻動(dòng)物的蛋白飼料添加成分[17]。棉花穩(wěn)產(chǎn)性是保障種植效益的首要因素，然而，由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的棉花黃萎病是影響當(dāng)前棉花穩(wěn)產(chǎn)性的最重要因素之一，因此，如何提高棉花品種的抗病性是當(dāng)今棉花育種的一個(gè)主要目標(biāo)。有關(guān)棉花抗病WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究已經(jīng)有一些報(bào)道，如GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GhWRKY1[20]。然而，棉花有116個(gè)WRKY蛋白，參與棉花抗病反應(yīng)的WRKY蛋白鑒定和其抗病反應(yīng)的分子機(jī)制等有待于進(jìn)一步研究。

本研究中，通過比對(duì)擬南芥中抗病相關(guān)的WRKY蛋白序列，分別在陸地棉中獲得這些蛋白的直系同源基因，分析這些GhWRKY基因?qū)Υ篼愝喼秩緯r(shí)的表達(dá)響應(yīng)。篩選出了對(duì)病原菌反應(yīng)劇烈的GhWRKY22基因，并對(duì)其進(jìn)行基因沉默(Knockdown)的研究。結(jié)果顯示，GhWRKY22基因沉默的植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性下降，同時(shí)抗病標(biāo)記基因(Marker genes)PDF1.2、PR1、PR3、PR4、PR5和PAL等的表達(dá)分析結(jié)果表明，GhWRKY22通過水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)信號(hào)途徑參與大麗輪枝菌抗性反應(yīng)?？傊珿hWRKY22基因正調(diào)控棉花對(duì)黃萎病的抗性，可以作為棉花抗病候選基因用于棉花的抗病育種。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1(Gossypiumhirsutumacc. TM-1)以及棉花抗黃萎病品系BD18由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所羅曉麗研究員提供。

根癌農(nóng)桿菌菌株 GV3101、大腸桿菌菌株 DH5α，均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所植物基因組國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

強(qiáng)致病力落葉型黃萎病菌菌株 V991 (Verticilliumdahliaestrain，V991)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡(jiǎn)桂良研究員惠贈(zèng)。

植物病毒誘導(dǎo)基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)技術(shù)系統(tǒng)，包括干擾表達(dá)載體 pYL156以及輔助載體 pYL192由清華大學(xué)劉玉樂教授饋贈(zèng)。

1.2 基因序列比對(duì)分析與進(jìn)化樹構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從模式植物擬南芥中選取抗病相關(guān)的WRKY編碼蛋白作為對(duì)象，在棉花數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.cottongen.org)中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，獲得了8個(gè)棉花直系同源WRKY編碼蛋白，利用Clustalx 2.1軟件進(jìn)行氨基酸多重比對(duì)，并使用 MEGA 5.0鄰接法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析。

1.3 棉花材料的培養(yǎng)

將干燥的硫酸脫絨種子在水中37 ℃浸泡過夜，移至培養(yǎng)盒中并在其上覆蓋2～3 cm厚的滅菌濕潤(rùn)的蛭石，置于暗處，每天補(bǔ)充適量水分以保證種子正常萌發(fā)。大約3 d后，將長(zhǎng)勢(shì)一致的棉花幼苗移植到注滿水的12孔水培盒中，放置于16 h光照/8 h黑暗、25 ℃、光強(qiáng)120 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天定時(shí)觀察適當(dāng)加水確保棉苗正常生長(zhǎng)，以備接菌和取樣。

1.4 棉花根部RNA的提取及cDNA合成

剪取不同處理棉花樣品，立即置于含液氮的研缽中迅速研磨成粉狀，隨后使用植物總RNA分離試劑盒(Sangon，上海)提取和純化組織樣品的總RNA，并用Nanodrop檢測(cè)RNA樣品的純度與濃度，其后通過1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的完整性，選擇純度和完整性優(yōu)良的RNA進(jìn)行cDNA合成。按照試劑盒提供的方法，用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(Transgen Biotech，北京，中國(guó))將1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA稀釋10倍置于-20 ℃冰箱保存。

1.5 基因片段克隆及載體構(gòu)建

選取GhWRKY22基因特異的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，并分別在正向引物和反向引物前添加限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ識(shí)別位點(diǎn)以及保護(hù)堿基(表1)。用TM-1遺傳標(biāo)準(zhǔn)系陸地棉的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增GhWRKY22基因，利用雙酶切法將目的片段插入到植物病毒表達(dá)載體 pYL-156中；酶切和測(cè)序鑒定正確后命名為pYL-156-GW22。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS植株培育

通過電擊法分別將pYL-156-GW22、pYL-156-PDS(陽(yáng)性對(duì)照載體)、pYL-156(空載體)和pYL-192輔助載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株GV3101中，PCR驗(yàn)證無(wú)誤備用。

將上述農(nóng)桿菌菌株在含有50 mg/mL卡那霉素、25 mg/mL利福平的液體LB培養(yǎng)基中于28 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。菌液在室溫下4 000 r/min離心7 min(Eppendorf 5810R，德國(guó))收集農(nóng)桿菌細(xì)胞。隨后將沉淀的菌體重新懸浮于MMA(10 mmol/L MES，10 mmol/L MgCl2，200 mmol/L AS)溶液中，調(diào)節(jié)至終濃度OD600為1.0～1.2，將含有pYL-156-PDS、pYL-156-GW22和pYL-156(空載體)的農(nóng)桿菌懸浮液分別與pYL-192等比例混合均勻，隨后室溫暗處孵育3 h備用。當(dāng)BD18棉花2片子葉完全展開時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)健壯一致的棉花幼苗進(jìn)行農(nóng)桿菌注射浸染。先用針頭在子葉背面劃出傷口，再用1 mL無(wú)針注射器將菌液從子葉背部傷口處注入，葉面浸染面積達(dá)90%以上為佳。侵染后的棉株室溫避光12 h左右，隨后移回光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.7 大麗輪枝菌活化和棉花接菌處理及其抗病性調(diào)查

將保存于-80 ℃的大麗輪枝菌菌株取適量均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)3 d后，挑取菌塊于100 mL查式培養(yǎng)液中，放置在28 ℃ 200 r/min搖床上培養(yǎng)，4～5 d后取出用8層醫(yī)用紗布過濾菌絲，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度，并用5%的蔗糖溶液調(diào)整其濃度為106個(gè)/mL備用。

TM-1棉花接種大麗輪枝菌的方法參考文獻(xiàn)[21]報(bào)道，簡(jiǎn)而言之，取長(zhǎng)勢(shì)一致并具有3片真葉的棉株，對(duì)其主根進(jìn)行統(tǒng)一傷根處理，將棉花根部浸泡到上述準(zhǔn)備好的菌液中，50 min后放回水培盒中并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收取0，12，24，36，48，72，96 h等不同處理時(shí)間的根樣品進(jìn)行棉花WRKY基因表達(dá)分析。

為了觀察棉花植株發(fā)病情況，根據(jù)范強(qiáng)等[22]報(bào)道，采用土培法對(duì)基因沉默BD18植株進(jìn)行接菌，并在接菌21 d后，統(tǒng)計(jì)植株的發(fā)病棵數(shù)和發(fā)病程度，計(jì)算發(fā)病率和病指。參照Wang等[21]報(bào)道，進(jìn)行大麗輪枝菌回復(fù)培養(yǎng)試驗(yàn)，簡(jiǎn)而言之：分別剪取對(duì)照組與試驗(yàn)組第一節(jié)間的莖段進(jìn)行表面滅菌(浸泡在25%～50%的84消毒液中5 min)后橫向切成小段，放置在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d后觀察這些切斷的大麗輪枝菌生長(zhǎng)狀況。

1.8 SA和JA處理

棉花幼苗具有2片真葉時(shí)，分別用茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)和水楊酸(Salicylic acid，SA)進(jìn)行激素誘導(dǎo)處理，具體方法參照先前報(bào)道的方法[23]。在激素處理0，0.5，1.0，3.0，6.0，12.0 h后分別取其根系，進(jìn)行GhWRKY22基因誘導(dǎo)表達(dá)分析。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析

以不同棉花樣本cDNA為模板和目的基因特異引物(表1)進(jìn)行qRT-PCR分析，具體反應(yīng)體系按照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒使用說明(Transgen Biotech Beijing，China)進(jìn)行配置，以棉花持家基因UBQ7為內(nèi)參基因。反應(yīng)使用的是IQ5多色檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)，反應(yīng)條件為 95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[24]，試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析篩查棉花抗病相關(guān)WRKY基因

WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性反應(yīng)等一系列過程，能夠調(diào)控多個(gè)生理途徑基因表達(dá)。在擬南芥中，已經(jīng)報(bào)道多個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植株的抗病反應(yīng)，主要包括WRKY7、33、3、22、48、70、72和40等(表2)。根據(jù)8個(gè)擬南芥WRKY抗病蛋白序列進(jìn)行(直系)同源比對(duì)，在棉花基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩查到11個(gè)棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子，如圖1所示，其中8個(gè)棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子分別與擬南芥的8個(gè)WRKY響應(yīng)的聚合在一起，暗示它們可能是直系同源基因。這些抗病相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子分布在3個(gè)WRKY類型中，在Ⅱ型的5個(gè)亞類a、b、c、d和e中也分別存在，說明參與調(diào)控抗病反應(yīng)的WRKY蛋白類型比較廣泛。

表2 擬南芥抗病相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子和其對(duì)應(yīng)棉花直系同源基因Tab.2 Defense related WRKY transcription factors in Arabidopsis and their orthologous genes in cotton

2.2 棉花抗病相關(guān)WRKY基因在大麗輪枝菌侵染下的表達(dá)響應(yīng)

棉花黃萎病是棉花的主要病害，其病原菌為大麗輪枝菌，因此，這8個(gè)與擬南芥直系同源的棉花WRKY基因表達(dá)是否對(duì)大麗輪枝菌產(chǎn)生應(yīng)答響應(yīng)，是研究這些GhWRKY基因抗病功能的前提。在水培盒中培養(yǎng)21 d大小的棉花苗被用于接菌試驗(yàn)。接種大麗輪枝菌后0，12，24，36，48，72，96 h進(jìn)行根部取樣，通過qRT-PCR方法分析這8個(gè)GhWRKY基因的表達(dá)情況。相對(duì)于0 h對(duì)照，其中有6個(gè)GhWRKY基因的表達(dá)在72 h之前均受到大麗輪枝菌誘導(dǎo)上調(diào)，另外2個(gè)WRKY基因(GhWRKY48和GhWRKY70)表達(dá)變化比較復(fù)雜，GhWRKY48的表達(dá)量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而GhWRKY70表現(xiàn)為升-降-升的趨勢(shì)。在圖2中GhWRKY7、GhWRKY40、GhWRKY22、GhWRKY3和GhWRKY72等5個(gè)WRKY基因表達(dá)量在24 h左右和72 h分別表現(xiàn)為上調(diào)，呈現(xiàn)出雙峰曲線，暗示這5個(gè)WRKY基因的表達(dá)量可能受到水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)2種激素信號(hào)的調(diào)控[25]。而GhWRKY48在病原菌浸染下總的表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，說明這個(gè)GhWRKY基因是一個(gè)負(fù)調(diào)控抗病的轉(zhuǎn)錄因子。

*.棉花直系同源基因。*.Orthologous cotton WRKYs.

熱圖的數(shù)值為相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行l(wèi)og2對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換值，處理0 h相對(duì)表達(dá)量對(duì)數(shù)值為0。The log2 value of the relative expression level shown in the heat map，and the value of 0 h treatment level is regarded as 0.

2.3 GhWRKY22組織表達(dá)和植物激素誘導(dǎo)表達(dá)分析

從上述正調(diào)控抗病的5個(gè)GhWRKY基因中，挑選GhWRKY22進(jìn)行深入的抗病功能分析。利用qRT-PCR分析棉花根、莖和葉器官中GhWRKY22基因表達(dá)量，結(jié)果顯示，該基因在棉花根、莖和葉中均有表達(dá)，但存在顯著差異(圖3-A)，其在莖中表達(dá)量最高，在葉中表達(dá)量最低。在圖2中已暗示GhWRKY22基因表達(dá)可能受到SA和JA抗病信號(hào)途徑的影響，因此，分別外源使用這2種抗病相關(guān)激素處理棉花植株，然后檢測(cè)GhWRKY22基因的表達(dá)情況。圖3-B顯示，在SA誘導(dǎo)3 h，GhWRKY22基因表達(dá)有了顯著的升高；而在JA處理后6，12 h，該基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著上升。這些數(shù)據(jù)表明，GhWRKY22基因表達(dá)受到SA和JA信號(hào)途徑的調(diào)控，從而參與棉花的抗病反應(yīng)。

A.GhWRKY22在棉花不同組織中的表達(dá)，不同小寫字母表示差異達(dá)5%(P<0.05)；B.SA和JA誘導(dǎo)下GhWRKY22表達(dá)情況。不同大寫字母表示SA處理下差異性達(dá)5%(P<0.05)；不同小寫字母表示JA處理下差異性達(dá)5%(P<0.05)。

2.4 GhWRKY22基因沉默植株的培育

為了進(jìn)一步分析GhWRKY22抗病功能，利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)技術(shù)來(lái)培育GhWRKY22基因沉默植株，分析GhWRKY22基因表達(dá)抑制時(shí)棉花植株的抗病性。首先，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析比對(duì)設(shè)計(jì)GhWRKY22基因特異靶序列(圖4-A、B)。利用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切把這個(gè)序列插入到煙草脆裂病毒(TRV)載體pYL156中，GhWRKY22構(gòu)建病毒誘導(dǎo)基因沉默載體pYL-156-GW22(圖4-B)。

A.GhWRKY22目的片段條帶的克?。籅.pYL192輔助載體與pYL-156-GW22沉默載體構(gòu)建示意圖，pYL192載體大小為6.8 kb，其中包含RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)、運(yùn)動(dòng)蛋白(Moveprotein，Mp)、16 ku蛋白(16 ku)序列，一個(gè)具有自我剪切功能的核酶(Ribozyme，Rz)序列以及強(qiáng)啟動(dòng)子(2×35S) 和NOS終止子序列，pYL-156-GW22載體大小為 10.4 kb，其中含有一個(gè)衣殼蛋白(Coatprotein，Cp)序列，一個(gè)用于各種目的基因片段構(gòu)建的多克隆位點(diǎn)(Multiple clone sites，MCS)等；C.GhPDS沉默植株葉片白化表型；D.GhWRKY22基因沉默分析，不同小寫字母表示差異達(dá)5%(P<0.05)。圖5-6同。

當(dāng)棉花苗的2片子葉完全展開時(shí)，進(jìn)行農(nóng)桿菌注射浸染。空載體pYL156農(nóng)桿菌作為浸染負(fù)對(duì)照，pYL156-PDS農(nóng)桿菌浸染作為正對(duì)照，PDS基因被沉默的植株表現(xiàn)為葉片失綠，一般作為病毒誘導(dǎo)基因沉默的標(biāo)記基因[22]。接種后的植株繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d左右，正對(duì)照植株呈現(xiàn)葉片失綠白化表型(圖4-C)，說明TRV系統(tǒng)在棉花中具有系統(tǒng)的感染，并能成功地進(jìn)行基因表達(dá)沉默。此時(shí)，GhWRKY22基因沉默植株的幼嫩葉片被取樣進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果表明，GhWRKY22基因在沉默植株中平均表達(dá)量顯著下降了60%左右(圖4-D)。選擇GhWRKY22基因表達(dá)沉默60%以上的10個(gè)植株接種大麗輪枝菌，分析這些沉默植株的抗病反應(yīng)。

2.5 沉默WRKY22基因植株對(duì)大麗輪枝菌的抗性分析

GhWRKY22沉默植株接種黃萎病菌21 d后，發(fā)現(xiàn)基因沉默植株表現(xiàn)為對(duì)病原菌侵染更敏感。相對(duì)于空載體沉默對(duì)照植株的發(fā)病癥狀，GhWRKY22沉默植株葉片黃色程度加重，落葉更多；GhWRKY22沉默植株的發(fā)病率和發(fā)病指數(shù)顯著高于對(duì)照(圖5-A-C)，發(fā)病株率和病情指數(shù)分別比對(duì)照升高了18百分點(diǎn)，20%，這些數(shù)據(jù)表明了GhWRKY22基因正調(diào)控棉花的抗病反應(yīng)。為了進(jìn)一步分析GhWRKY22基因的抗病功能，接菌沉默植株中大麗輪枝菌菌絲生長(zhǎng)情況也被檢測(cè)。首先分析接菌植株主莖斷面在培養(yǎng)基上病原菌回復(fù)情況，結(jié)果顯示，GhWRKY22基因沉默植株的病原菌回復(fù)率明顯高于對(duì)照(圖5-D)。歸納這些試驗(yàn)結(jié)果，可以證明GhWRKY22基因參與棉花對(duì)黃萎病的抗性，并且正調(diào)控棉花的抗病性。

GhWRKY22基因表達(dá)受到SA和JA激素的誘導(dǎo)(圖3)，因此，GhWRKY22沉默植株對(duì)黃萎病的抗性下降，也可能涉及SA和JA信號(hào)途徑中的基因調(diào)控。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，利用qPCR技術(shù)分析SA和JA信號(hào)途徑中抗病標(biāo)志基因的表達(dá)情況。在GhWRKY22基因沉默植株和對(duì)照接種大麗輪枝菌21 d后，分析SA和JA抗病標(biāo)志基因PR1、PR3、PR4、PR5、PAL1和PDF1.2表達(dá)水平。結(jié)果表明，基因沉默植株中6個(gè)抗病標(biāo)志基因的表達(dá)量顯著低于對(duì)照植株，其中PR4和PDF1.2的表達(dá)量下降最大，僅為對(duì)照的3.7%，8.7%。這些結(jié)果進(jìn)一步表明GhWRKY22基因通過SA和JA信號(hào)途徑參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性(圖6)。

A.GhWRKY22基因沉默植株發(fā)病情況；B.發(fā)病株率，試驗(yàn)重復(fù)3次，共計(jì)60個(gè)植株；C.病情指數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，共計(jì)60個(gè)植株；D.接菌植株莖段恢復(fù)培養(yǎng)5 d后大麗輪枝菌生長(zhǎng)情況。

圖6 大麗輪枝菌浸染GhWRKY22沉默植株和對(duì)照中抗病標(biāo)志基因的表達(dá)分析Fig.6 The relative expression level of defense marker genes in GhWRKY22-silenced plants treated with V. dahliae

3 結(jié)論與討論

植物WRKY基因參與一系列的生理生化過程，包括植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界環(huán)境的抗性。其中有許多WRKY蛋白參與植物對(duì)病原菌抗性，在模式植物擬南芥中已經(jīng)報(bào)道了許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與抗病反應(yīng)。然而在棉花中只有少數(shù)幾個(gè)WRKY蛋白被報(bào)道參與抗病反應(yīng)，如GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GhWRKY1[20]。相比較于擬南芥，棉花中肯定存在著其他沒有鑒定的WRKY蛋白也參與抗病反應(yīng)。因此，利用比較基因組方法，通過生物信息學(xué)技術(shù)鑒定了8個(gè)與擬南芥直系同源的GhWRKY基因，通過接菌誘導(dǎo)反應(yīng)顯示棉花中這8個(gè)WRKY基因均參與大麗輪枝菌的應(yīng)答反應(yīng)。并利用基因沉默技術(shù)證明了GhWRKY22參與棉花的抗病反應(yīng)。

本研究結(jié)果顯示，8個(gè)棉花WRKY基因的表達(dá)受到大麗輪枝菌的誘導(dǎo)，但是誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢(shì)不同，GhWRKY7、GhWRKY72、GhWRKY40等6個(gè)WRKY基因表達(dá)一直為上調(diào)，而GhWRKY48的表達(dá)表現(xiàn)為下調(diào)，GhWRKY70的表達(dá)比較復(fù)雜。在棉花中前人已經(jīng)報(bào)道了3個(gè)抗病相關(guān)WRKY，包括GhWRKY3[18]、GhWRKY40[19]和 GbWRKY1[20]。Guo 等[18]報(bào)道了GhWRKY3表達(dá)受到多種激素誘導(dǎo)，同時(shí)也受到立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、棉花炭疽菌(Colletotrichumgossypii)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的誘導(dǎo)。在SA、MeJA和ET處理下，GhWRKY40基因表達(dá)上調(diào)，正調(diào)控茄科植物對(duì)雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)抗性[19]。Li等[20]研究結(jié)果顯示海島棉GbWRKY1通過JA信號(hào)途徑介導(dǎo)棉花抗病和發(fā)育的轉(zhuǎn)變，負(fù)調(diào)控棉花對(duì)灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和大麗輪枝菌抗性。在本研究中的8個(gè)直系同源的抗病WRKY基因包含著GhWRKY3和GhWRKY40，都是正調(diào)控棉花黃萎病的抗性反應(yīng)。另外，本研究中有6個(gè)WRKY基因正調(diào)控棉花大麗輪枝菌應(yīng)答反應(yīng)，但同時(shí)也存在負(fù)調(diào)控應(yīng)答反應(yīng)GhWRKY48。擬南芥中，利用突變體和過表達(dá)植株也證明了WRKY48負(fù)調(diào)控細(xì)菌基礎(chǔ)抗性以及PR基因的表達(dá)[11]；上面論述的海島棉GhWRKY1也是一個(gè)抗病負(fù)調(diào)控因子；在番茄中，SlWRKY70的轉(zhuǎn)錄水平也表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控植株對(duì)真菌的抗性[26]。因此，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物的抗病反應(yīng)既可以是正向調(diào)控也可以是負(fù)向調(diào)控。

本研究表明，GhWRKY22基因受到大麗輪枝菌浸染的誘導(dǎo)，其表達(dá)量隨著時(shí)間的變化呈現(xiàn)雙峰形式的上調(diào)，利用VIGS技術(shù)確證了GhWRKY22正調(diào)控棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性。通過激素誘導(dǎo)GhWRKY22防御反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其可能是受到JA和SA交叉信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控，是植物抗病反應(yīng)中重要調(diào)控蛋白，有望成為一個(gè)新的棉花抗病育種的候選基因。Zhang等[27]也報(bào)道了一個(gè)棉花WRKY22基因的抗病功能，這個(gè)基因和本研究中的GhWRKY22基因是同源基因，不是擬南芥WRKY22的直系同源基因；然而有趣的是這2個(gè)基因都參與棉花對(duì)大麗輪枝菌的抗性，它們之間是否存在功能疊加或冗余現(xiàn)象有待深入的研究。在擬南芥中[10]，通過野生型與突變體wrky22-1和wrky22-2在淹水處理下比較，發(fā)現(xiàn)WRKY22也具有較低的抗病性和先天性免疫特性。此外，Abbruscato等[28]在水稻也報(bào)道了OsWRKY22基因位于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)回路的交匯點(diǎn)，參與對(duì)稻瘟病的抗性?？傊?，GhWRK22是一個(gè)抗病正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，可以作為抗病候選基因用于棉花的抗病品種培育。