SSR標(biāo)記與陸地棉田間黃萎病抗性的關(guān)聯(lián)分析

張素君，唐麗媛，李興河，王海濤，劉存敬，張香云，張建宏

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所，農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051)

陸地棉(GossypiumhirsutumL.)是世界上最重要的天然纖維作物，也是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。黃萎病是一種嚴(yán)重的土傳病害，寄主范圍廣泛[2]。目前，國(guó)內(nèi)缺乏高抗黃萎病的陸地棉品種，且沒(méi)有有效治愈黃萎病的殺菌劑，使得黃萎病成為危害棉花的最大病害之一[3-4]。2009-2010年，超過(guò)我國(guó)棉花種植面積的50%受到黃萎病的影響(美國(guó)國(guó)家棉花委員會(huì)-疾病數(shù)據(jù)庫(kù))[5]。培育和推廣抗病品種是防治棉花黃萎病的有效方法[3]。

由于當(dāng)前陸地棉品種遺傳背景狹窄，且抗病性和產(chǎn)量、纖維品質(zhì)之間存在一定程度的遺傳負(fù)相關(guān)性[6]，實(shí)現(xiàn)三者的同步改良是一項(xiàng)艱巨的考驗(yàn)。分子數(shù)量遺傳學(xué)發(fā)展為實(shí)現(xiàn)遺傳改良提供了有效的工具，通過(guò)挖掘抗病性相關(guān)的QTLs(Quantitative trait loci)應(yīng)用于分子輔助育種可加速選育抗病品種的進(jìn)程。

為了挖掘抗病性相關(guān)的QTLs，不同研究者利用2個(gè)不同黃萎病抗性的棉花材料構(gòu)建分離群體，通過(guò)連鎖作圖定位到眾多與抗黃萎病性狀相關(guān)的QTLs[7-13]。同時(shí)，隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，基于連鎖不平衡的關(guān)聯(lián)分析在植物基因組學(xué)研究領(lǐng)域取得了成功的應(yīng)用[14]。與連鎖作圖相比，全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide Association Study,GWAS)具有精確度高、不需專(zhuān)門(mén)構(gòu)建群體、同時(shí)分析同一位點(diǎn)的多個(gè)等位基因等優(yōu)點(diǎn)[15-17]。

近年來(lái)，關(guān)聯(lián)分析方法已開(kāi)始應(yīng)用于棉花黃萎病抗性的研究。郭志軍等[18]采用 74 個(gè) Simple sequence repeat(SSR)標(biāo)記對(duì) 172 份陸地棉栽培種的基因組變異進(jìn)行掃描，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn) 12個(gè)與黃萎病抗性顯著相關(guān)(P<0.05)的位點(diǎn)；李黎貝[19]利用140 個(gè)SSR標(biāo)記在 186 份陸地棉材料中共檢測(cè)出 355 個(gè)等位變異，挖掘與棉花黃萎病抗性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)22個(gè)(P<0.01)。Zhao等[20]搜集了世界各地的158份陸地棉資源，在全基因組內(nèi)均勻篩選212個(gè)多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記，在成株期和苗期對(duì)陸地棉的黃萎病抗性進(jìn)行了鑒定，利用關(guān)聯(lián)分析挖掘了42個(gè)與黃萎病抗性關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，其中有30個(gè)為首次挖掘，此外，本研究在16號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了與黃萎病抗性相關(guān)的QTL簇。目前，通過(guò)關(guān)聯(lián)分析挖掘陸地棉黃萎病抗性相關(guān)位點(diǎn)取得了一定的進(jìn)展，但是與棉花其他性狀比如纖維品質(zhì)、產(chǎn)量相比[1,6,21-24]，相關(guān)研究尚不充足。

本研究通過(guò)分析214份陸地棉資源的遺傳多樣性，利用黃萎病病圃對(duì)其多年發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，利用均勻分布于棉花基因組上的237個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行全基因組掃描，發(fā)掘與棉花黃萎病抗性顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，旨在為棉花抗黃萎病性狀的分子檢測(cè)及標(biāo)記輔助選擇育種提供參考信息。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

214份陸地棉資源均由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所分子育種室提供，包括我國(guó)陸地棉栽培種(107個(gè))、搜集于國(guó)內(nèi)的資源(55份)、國(guó)外的資源(7份)、本實(shí)驗(yàn)室自選的育種材料(45個(gè))。這些材料來(lái)源廣泛，表型性狀比如株高、纖維品質(zhì)、熟性、衣分、產(chǎn)量、葉色、株形等方面差異顯著。2013-2015年將上述材料種植于河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所小安舍試驗(yàn)站田間病圃(河北石家莊)，該田間病圃是多年植棉又經(jīng)過(guò)人工改造的黃萎病病田，經(jīng)多年田間觀察統(tǒng)計(jì)，具有與黃萎病病圃相當(dāng)?shù)闹虏⌒Ч?。試?yàn)采用3行區(qū)，行長(zhǎng)7.5 m，行距0.8 m。定苗時(shí)每行留27株左右。采用局部隨機(jī)排列，設(shè)3個(gè)重復(fù)。組內(nèi)每隔10個(gè)品種設(shè)感病對(duì)照品種(冀棉11)一次。

1.2 田間黃萎病抗病性鑒定

黃萎病鑒定采用田間成株期鑒定，參考國(guó)家棉花品種區(qū)試中抗黃萎病的鑒定方法[25]。根據(jù)黃萎病發(fā)病高峰期分別于每年8月底至9月初進(jìn)行田間鑒定，每重復(fù)取中間行20株調(diào)查黃萎病發(fā)病情況，感病對(duì)照為冀棉11，采用3個(gè)重復(fù)相對(duì)病情指數(shù)(Relative disease index，RDI)平均值表示各個(gè)材料的抗病性強(qiáng)弱[25]。

1.3 棉花總DNA的提取與檢測(cè)

CTAB法提取基因組DNA[26]，采用1%瓊脂糖檢測(cè)DNA完整性和雜質(zhì)，采用分光光度計(jì)Nanodrop 2000檢測(cè)，稀釋至終濃度25～40 ng/μL。

1.4 PCR體系與電泳檢測(cè)

本試驗(yàn)從6 000余對(duì)SSR引物中選取237個(gè)擴(kuò)增效果穩(wěn)定、多態(tài)性好且分布在棉花26條染色體上的SSR標(biāo)記用于群體擴(kuò)增，引物在染色體上的位置參考Liang等[27]構(gòu)建的連鎖圖譜。所有引物信息均可從CottonGen(http://www.com.cottongen.org/)和CMD(http://www.cottonmarker.org/)查取。PCR(Polymerase chain reaction)反應(yīng)體系10 μL，模板DNA 1.2 μL，天根2×TaqRCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 3 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，8%的垂直板非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，參考張軍等[28]方法銀染。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

人工讀帶，同一位置上清晰且重復(fù)性好的記為“1”，無(wú)帶記為“0”，帶弱或模糊不清的記為缺省值；利用Powermarker 3.25[29]計(jì)算引物的多態(tài)性位點(diǎn)、多態(tài)性信息含量和多樣性指數(shù)，并利用其Phelogeny功能，計(jì)算Nei氏遺傳距離，構(gòu)建群體材料的Neighbor-Joining(NJ)聚類(lèi)圖；利用Structure 2.2 軟件[30]估測(cè)該自然群體遺傳結(jié)構(gòu)，計(jì)算獲得Q值。K值為1～10，將MCMC(Markov chain monte carlo)開(kāi)始時(shí)的不作數(shù)迭代(Length of burn-in period)設(shè)為10 000次，采用Evanno等[31]提出的ΔK值方法確定合適K值；利用Tassel 2.1軟件的一般線性模型(General linear model，GLM)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并計(jì)算各標(biāo)記對(duì)表型變異的解釋率[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉資源的黃萎病抗性統(tǒng)計(jì)

對(duì)214份陸地棉資源進(jìn)行抗病性鑒定表明，陸地棉在黃萎病抗性上表現(xiàn)出廣泛的變異。在田間病圃鑒定條件下，2013年的RDI變化為5.6～91.6，平均為30.6，2014年的RDI變化為1.5～98.3，平均為26.0，2015年的RDI變化為0～90.0，平均為33.3(圖1)。方差分析表明：相同年份3個(gè)重復(fù)內(nèi)的相對(duì)病情指數(shù)(RDI)不存在顯著差異(P>0.5)，而不同材料間RDI存在極顯著差異(P<0.01)。不同年份之間進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，2014年黃萎病整體發(fā)病情況與其他2年相比較輕，年份效應(yīng)顯著。3年均表現(xiàn)抗病(RDI<20)的材料有18份，其中，本實(shí)驗(yàn)室自選的育種材料6份(抗8、冀棉18選系、冀選系258、冀選系120、Z56-1系、JMX-20)，栽培品種11份(冀棉958、中棉所69、冀151、冀122、新陸中44、德利農(nóng)5號(hào)、仁和39號(hào)、中棉所40、冀優(yōu)768、冀棉616、冀228)，資源材料1份(馬里4號(hào))。

2.2 SSR分子標(biāo)記多態(tài)性信息

利用PowerMarker v3.25計(jì)算軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，237個(gè)SSR引物共檢測(cè)到280個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，涉及695個(gè)等位變異，變異范圍 2～6 個(gè)，平均等位變異數(shù)為2.479 0個(gè)(表1)。JESPR153、BNL169和BNL3442檢測(cè)到的等位變異數(shù)最多為6個(gè)，多態(tài)性信息含量(PIC)變幅為0.004 9(NAU3816)～0.610 8(JESPR153)，平均0.213 3；基因多樣性指數(shù)變異為0.004 9(NAU3816)～0.665 5(JESPR153)，平均為0.255 8。SSR引物在所選棉花品種中檢測(cè)的等位變異數(shù)目和基因多樣性的跨度較大，但平均值較低，說(shuō)明所選擇的棉花材料在基因組水平上變異比較豐富，但整體上所選陸地棉的遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。

圖1 田間病圃鑒定條件下供試材料病指變化頻率分布Fig.1 Histogram of relative disease index of tested lines identified in field disease nursery

表1 SSR 標(biāo)記多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)Tab.1 Statistics of SSR marker polymorphism information

2.3 聚類(lèi)分析

利用PowerMarker v3.25軟件中的Phelogeny功能，根據(jù)280個(gè)具有多態(tài)性位點(diǎn)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，計(jì)算Nei氏遺傳距離；并基于該遺傳距離，構(gòu)建群體材料的Neighbor-Joining(NJ)聚類(lèi)圖。采用Nei氏距離對(duì)該自然群體進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)，可以分為3個(gè)亞群，分別包含8，79，127份材料。此分類(lèi)與材料類(lèi)型無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系。8份材料中有5份資源材料、3個(gè)品種，其中，7份材料在群體結(jié)構(gòu)分析中劃分為第1亞群；79份材料中有33份育種中間材料、31個(gè)品種和15份資源材料，在群體結(jié)構(gòu)劃分中均被劃分為第1亞群；127份材料中有73個(gè)栽培品種、42份資源材料和12份育種中間材料，在群體結(jié)構(gòu)劃分中有70份劃分為第1亞群，57份材料劃分為第2亞群。聚類(lèi)結(jié)果與材料的地域來(lái)源無(wú)顯著對(duì)應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明不同育種單位之種質(zhì)流動(dòng)性較大，打破了種質(zhì)的地域界限。

圖2 214份陸地棉資源基于SSR標(biāo)記的聚類(lèi)Fig.2 Clustering map of 214 upland cotton based on SSR markers

2.4 群體結(jié)構(gòu)分析

利用 Structure 2.2軟件中的混合模型聚類(lèi)分析法對(duì)214份陸地棉的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行劃分，在K=1～10時(shí)，隨著K值的增大，模型的后驗(yàn)概率(Lnp Posterior probability，Ln P(D))也持續(xù)增大，因而，無(wú)法依據(jù)最大似然值的原則確定合適的K值。參照 Evanno 等[31]的方法計(jì)算ΔK值，ΔK在K=2時(shí)出現(xiàn)頂點(diǎn)，推測(cè)該自然群體分為2個(gè)亞群(圖3),2個(gè)亞群分別包含156，58份材料。此結(jié)果與利用NJ聚類(lèi)方法分析結(jié)果略有差別，但共同表明供試群體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，來(lái)源較為單一，在一定程度上反映了陸地棉品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。

圖3 214份陸地棉材料的群體結(jié)構(gòu)Fig.3 The population structure of 214 upland cotton germplasm

2.5 陸地棉SSR位點(diǎn)間的連鎖不平衡分析

利用Tassel 2.1進(jìn)行連鎖不平衡分布(LD)分析，共有204個(gè)標(biāo)記覆蓋了整個(gè)棉花基因組2 918.7 cM，標(biāo)記間的平均距離為14.38 cM，平均每條染色體上有7.85個(gè)位點(diǎn)，另有33個(gè)標(biāo)記尚未定位到染色體上。237個(gè)標(biāo)記在供試群體中檢測(cè)到了280個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，這些位點(diǎn)間的連鎖不平衡分布如圖4所示。在280個(gè)位點(diǎn)的39 060種位點(diǎn)組合中，連鎖不平衡位點(diǎn)廣泛存在于共線性組合和非共線性組合中，概率統(tǒng)計(jì)極顯著支持(P<0.01)的成對(duì)位點(diǎn)占總組合數(shù)的3.73%(圖4)，所選陸地棉基因組內(nèi)的連鎖不平衡水平較低。

2.6 關(guān)聯(lián)分析

通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，在不同年份中發(fā)掘與黃萎病抗性顯著關(guān)聯(lián)(P<0.01)的SSR位點(diǎn)27個(gè)(表2)，其中有2個(gè)位點(diǎn)(BNL3442和BNL1064)在3年均被重復(fù)檢測(cè)到，表型變異解釋率最高分別為12.10%和8.02%。3個(gè)位點(diǎn)(Gh433-2、NAU3607和JESPR153)在2013,2014年同時(shí)檢測(cè)到與黃萎病抗性顯著關(guān)聯(lián)；6個(gè)位點(diǎn)(BNL3902、NAU5428、BNL1646-1、BNL1646-2、CGR5996和HAU1774-1)在2014,2015年同時(shí)檢測(cè)到與黃萎病抗性顯著關(guān)聯(lián)，其中，NAU5428的2年表型變異解釋率較高，分別為6.93%和5.57%；其余16個(gè)位點(diǎn)僅在一個(gè)年份檢測(cè)到與黃萎病抗性相關(guān)聯(lián)。這些在不同年份中穩(wěn)定存在的SSR標(biāo)記位點(diǎn)有可能與抗病基因緊密連鎖，有望用于棉花黃萎病抗性材料篩選和抗病基因挖掘中。

圖4 SSR位點(diǎn)間的連鎖不平衡Fig.4 The linkage disequilibrium between SSR loci

表2 與黃萎病抗性相關(guān)的SSR位點(diǎn)Tab.2 SSR loci associated with Verticillium wilt-resistance

本研究通過(guò)對(duì)抗黃萎病性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的同時(shí)，挖掘出一些與棉花抗黃萎病穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的SSR位點(diǎn)(BNL3442和BNL1064)，可以為抗黃萎病候選位點(diǎn)做進(jìn)一步驗(yàn)證，并挖掘優(yōu)異等位變異，對(duì)棉花抗黃萎病分子育種具有重要的理論和實(shí)踐意義。同時(shí)，本研究通過(guò)3年陸地棉資源的黃萎病抗性統(tǒng)計(jì)，鑒定了一批抗病性突出的育種材料和資源，為棉花抗病育種提供了參考。

3 結(jié)論與討論

3.1 黃萎病鑒定方法

目前，對(duì)于棉花黃萎病抗性的鑒定，主要有田間病圃鑒定、營(yíng)養(yǎng)缽苗期鑒定和黃萎病毒素法鑒定[33]。其中，田間病圃鑒定是棉花種質(zhì)抗黃萎病鑒定常用且能真實(shí)反映鑒定材料抗性強(qiáng)弱的方法，但由于大田鑒定存在不同材料成熟期早晚和接種量的差異，以及試驗(yàn)小區(qū)的干擾等，存在不同年份、不同棉區(qū)篩選的抗黃萎病材料的抗病性差異較大的情況。通過(guò)設(shè)置合適的感病對(duì)照品種，利用相對(duì)病情指數(shù)來(lái)描述棉花的抗病性是減少環(huán)境變異的有效措施[4,34]。本研究中，使用冀棉11同一批種子作為感病對(duì)照，最大程度保證了標(biāo)準(zhǔn)品種年度間抗病性的一致。本研究結(jié)果表明，盡管努力減少試驗(yàn)的環(huán)境誤差，仍然存在部分材料在不同年份間鑒定結(jié)果差異較大的情況，可能是由于陸地棉黃萎病抗性屬數(shù)量性狀遺傳[35]，容易受到環(huán)境變化的影響。通過(guò)上述鑒定方法篩選出3年均表現(xiàn)為抗黃萎病的材料18份，這些材料中可能含有多環(huán)境穩(wěn)定的抗黃萎病優(yōu)勢(shì)等位基因，需要在分子水平進(jìn)行進(jìn)一步挖掘。這些材料經(jīng)其他鑒定方法重復(fù)檢驗(yàn)后，有望作為抗黃萎病材料用于棉花育種工作中。

3.2 群體結(jié)構(gòu)分析

群體結(jié)構(gòu)是影響關(guān)聯(lián)分析的一個(gè)重要因素，研究一個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)組成時(shí)，會(huì)因?yàn)閬喨旱幕旌蠈?dǎo)致整個(gè)群體的連鎖不平衡水平增強(qiáng)，假陽(yáng)性結(jié)果增加[36]，如果群體結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，假陽(yáng)性關(guān)聯(lián)結(jié)果出現(xiàn)的可能性就會(huì)減少[37]。因此，在進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析前對(duì)自然群體進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析很有必要。本研究中，聚類(lèi)結(jié)果顯示，所選群體被分為3個(gè)亞群，群體結(jié)構(gòu)分析表明，供試材料被分為2個(gè)亞群，2個(gè)聚類(lèi)結(jié)果差異并不大，共同說(shuō)明了所選陸地棉整體上遺傳背景狹窄。這也解釋了本研究中SSR引物在所選棉花品種中檢測(cè)的等位變異數(shù)目和基因多樣性的跨度較大，但平均值較低的問(wèn)題。由于群體結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單，本研究?jī)H利用GLM模型進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析。

3.3 黃萎病相關(guān)分子標(biāo)記的獲得及利用

本研究通過(guò)關(guān)聯(lián)分析獲得了與黃萎病性狀顯著關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)27個(gè)，與前人黃萎病抗性相關(guān)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果進(jìn)行比較[18-20]，Zhao等[20]利用212個(gè)SSR標(biāo)記與陸地棉成株期和苗期的黃萎病抗性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，鑒定出NAU5428與黃萎病極顯著相關(guān)(P<0.000 1)，解釋表型變異率達(dá)10.93%，本研究中，此標(biāo)記在2年田間鑒定中與黃萎病顯著相關(guān)，解釋表型變異率分別為6.93%和5.57%，此結(jié)果表明了本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果的一致性。

隨著黃萎病抗性相關(guān)的QTLs的不斷挖掘，已經(jīng)有一些分子標(biāo)記陸續(xù)應(yīng)用于棉花抗病基因分子標(biāo)記輔助選擇育種上[4,38-41]。王芙蓉等[38]研究發(fā)現(xiàn)，標(biāo)記 NAU751 和BNL1395 的抗性基因型聚合后可顯著提高后代的抗性水平；孔祥瑞等[39]研究發(fā)現(xiàn)，BNL1721、BNL2733和 BNL3452這 3個(gè)標(biāo)記的黃萎病抗性選擇效應(yīng)能夠在不同世代間穩(wěn)定遺傳；祁偉彥等[40]利用和黃萎病抗性緊密連鎖的 SSR 標(biāo)記對(duì)棉花黃萎病抗性進(jìn)行了輔助篩選，提出將人工病圃篩選和分子標(biāo)記輔助育種相結(jié)合是選育棉花抗黃萎病材料可行、高效的育種方法。趙云雷等[4]研究表明，抗黃萎病優(yōu)異等位基因的累加具有明顯提高抗病性的作用，材料抗病性的強(qiáng)弱在一定程度上可以通過(guò)優(yōu)異等位基因數(shù)目和效應(yīng)值之和來(lái)反映，這就為分子方法鑒定抗病性強(qiáng)弱提供了依據(jù)，同時(shí)為黃萎病關(guān)聯(lián)位點(diǎn)利用提供了重要參考。

通過(guò)關(guān)聯(lián)分析挖掘了多個(gè)與陸地棉黃萎病抗性關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為棉花抗黃萎病性狀的分子檢測(cè)及標(biāo)記輔助選擇育種提供信息。今后應(yīng)進(jìn)一步挖掘與棉花抗黃萎病性狀顯著關(guān)聯(lián)的優(yōu)異等位基因位點(diǎn)，逐步實(shí)現(xiàn)抗病基因型的直接選擇，有效縮短抗病性的鑒定周期。