MyoG基因多態(tài)性與牦牛生長性能的關(guān)聯(lián)分析

柴志欣，信金偉，王 會，郭 琳，鐘金城，張成福，姬秋梅

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點實驗室，四川 成都 610041；3.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院,省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850009)

生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic regulatory factors，MRFs)家族主要包括生肌決定因子(Myogenic determining factor，MyoD)、生肌調(diào)節(jié)因子4(Myogenic regulatory factor 4，MRF4)、肌細(xì)胞生成素(Myogenin，MyoG)和生肌決定因子5(Myogenic fatcor 5，MYF5)[1]，主要控制骨骼肌正常生長發(fā)育，體肌細(xì)胞定型、增殖，成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及肌纖維形成，同時對肌肉功能完善發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，MyoG在所有骨骼肌細(xì)胞中均可表達(dá)，其可調(diào)控中胚層細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞、再由成肌細(xì)胞融合成肌纖維[3-4]，是該家族中唯一能在骨骼肌細(xì)胞發(fā)育與生長過程中均可表達(dá)的調(diào)控因子。Neville、Weintraub等[5-6]敲除生肌調(diào)節(jié)基因家族4個轉(zhuǎn)錄因子，其中單獨敲除MyoG基因的小鼠骨骼肌發(fā)育受損進(jìn)而死亡，且個體發(fā)育較正常小鼠?。欢鴨为毲贸渌?個基因的小鼠，骨骼肌發(fā)育正常。肌細(xì)胞生成素具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能，對其他因子起調(diào)控作用，MyoG可調(diào)控MRF4基因表達(dá)，也可通過調(diào)節(jié)肌肉肌酸激酶、肌鈣蛋白和肌球蛋白輕鏈基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)肌肉特異性。其作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，表達(dá)并啟動骨骼肌特異胚胎性受體和收縮蛋白的合成[7]。Wright等[1]研究表明，MyoG基因作為一種正調(diào)控因子，影響小鼠骨骼肌發(fā)育。Fujisawa-Sehara等[8]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠胚胎發(fā)生期，MyoG基因上游序列可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄激活。Buonanno等[9]研究表明,MyoG基因上游區(qū)域可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠組織發(fā)育的特異性表達(dá)。

牦牛生長性狀是選育工作的重要參考指標(biāo)，MyoG基因是骨再塑的重要調(diào)控因子，對骨骼肌發(fā)育成熟發(fā)揮重要作用，而骨骼生長在大型畜種中主要表現(xiàn)在體高、體長等生長指標(biāo)上?；贛yoG基因在 MRFs 基因家族中的決定性作用，其調(diào)控機(jī)制已得到廣泛研究，但目前對牦牛該基因的研究較少。

本研究以西藏主要牦牛類群及四川麥洼牦牛為對象，分析MyoG基因遺傳多樣性及與生長性狀的相關(guān)性，尋找新的性狀關(guān)聯(lián)SNPs位點，以期應(yīng)用于牦牛育種實踐，提高生產(chǎn)性能，為牦牛分子標(biāo)記輔助選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本采集

選取四川麥洼牦牛、西藏類烏齊牦牛、申扎牦牛、帕里牦牛、斯布牦牛5個類群共286頭健康成年個體(表1)。采集耳組織，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r測定其體高、體斜長、胸圍、管圍、體質(zhì)量等生長性能指標(biāo)。按照動物組織基因組DNA提取試劑盒說明進(jìn)行提取，1% 凝膠電泳和分光光度計檢測其純度及濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試牦牛樣品清單Tab.1 List of samples used for analyses

1.2 牦牛體尺性狀測定

測量需牦牛端正站立于寬闊、平坦地面上。四肢直立，從后面向前看只能看見后腿而不見前腿，側(cè)望左腿不見右腿或右腿不見左腿，頭自然前伸，不左不右，不高不低，4蹄落在地面2條平行的直線上。體質(zhì)量測定采用電子磅秤，測杖測量牦牛個體高度、體斜長。體高測量標(biāo)準(zhǔn)為耆甲最高點到地面的垂直距離，體斜長通常稱體長，肩端至坐骨端的距離，卷尺測量胸圍、管圍。胸圍為肩胛后角處體軀的垂直周徑。管圍為前肢脛部上1/3的周徑，一般在脛部最細(xì)處測量[10]，每項測量2次，取平均值。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA池構(gòu)建 重復(fù)測定DNA濃度，取其3次平均值，稀釋至50 ng/μL。100個DNA樣品各取5 μL混合，4 ℃靜置24～48 h。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank牛MyoG基因序列(AC_000173)，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計PCR引物(表 2)。

PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：DNA模板2 μL，上下游引物各2 μL，ddH2O 19 μL、Premix ExTaq聚合酶25 μL。

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸(具體如表2所示)，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。10 g/L凝膠電泳檢測，純化、回收后送往英濰捷基(上海)生物科技有限公司測序。

1.3.3 SNPs篩查及數(shù)據(jù)分析 利用BioEdit 7.0.5軟件將擴(kuò)增序列與參考序列比對，查找雙峰(突變位點)。利用直接測序法驗證突變位點，并判定基因型。

統(tǒng)計不同基因型個體數(shù)量，利用PIC_CALC、Popgen 32、SPSS 17.0等軟件分析多態(tài)指數(shù)，Hardy-Weinberg平衡檢測及進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。

表2 候選基因引物信息Tab.2 Information of primer in candidate gene

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛體尺性狀比較

從286頭牦牛樣品中，篩選年齡結(jié)構(gòu)相同的牦牛個體進(jìn)行體尺性狀比較。由表3可知，申扎牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍和體質(zhì)量等指標(biāo)均明顯小于麥洼牦牛、類烏齊牦牛和帕里牦牛。申扎和斯布2個牦牛類群體質(zhì)量及體尺指標(biāo)接近，申扎牦牛在西藏當(dāng)?shù)胤Q為矮小牦牛，群體個體均較小，而斯布牦牛稱為矮腳牦牛，其肢長指數(shù)較小，因其在地理條件、生態(tài)環(huán)境較為相近且年降水量稀少導(dǎo)致植被及牧草長勢較差從而影響其發(fā)育。帕里牦牛體高、胸圍和體質(zhì)量指標(biāo)均優(yōu)于其他類群。5個類群中，公牦牛各項體尺指標(biāo)普遍大于母牦牛，但在斯布牦牛體質(zhì)量指標(biāo)中，母牦牛的體質(zhì)量明顯大于公牦牛。牦牛的生長與氣候及牧草生長情況密切相關(guān)。

表3 牦牛類群的體尺性狀方差分析(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.3 Analysis of variance on growth traits in yak

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)；表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±數(shù)準(zhǔn)差。表4，7同。

體尺指數(shù)是衡量牦牛發(fā)育完全的重要參考標(biāo)準(zhǔn)，其中，體長指數(shù)表明高和長相對發(fā)育程度，胸圍指數(shù)說明胸部寬和深相對發(fā)育程度，管圍指數(shù)反映骨骼的發(fā)育程度。各相關(guān)指數(shù)計算方法均為與體高的百分比[11]。由表4可知，麥洼牦牛和類烏齊牦牛各項指數(shù)較接近，類烏齊牦牛胸圍指數(shù)高于其他4個類群，說明其胸部肌肉發(fā)育較好。麥洼牦牛和類烏齊牦牛雌性個體的體長、胸圍指數(shù)較接近，2個品種均具有較典型的乳肉兼用體型。申扎牦牛體長指數(shù)較小但管圍較大，與實際情況相符。帕里牦牛胸圍和管圍指數(shù)較其他牦牛類群偏低，與體型特征相符。

表4 五個牦牛品種(類群)平均體尺指數(shù)比較(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.4 Comparison body size average index of five yak %

2.2 MyoG基因的多態(tài)性分析

2.2.1 PCR 產(chǎn)物檢測 擴(kuò)增目的片段，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期擴(kuò)增片段長度一致。

圖1 MyoG基因PCR擴(kuò)增Fig.1 The amplification result of MyoG from PCR

2.2.2 序列分析 將測序結(jié)果與參考序列比對、校正，根據(jù)峰值圖篩查SNPs位點，發(fā)現(xiàn)MyoG基因存在4個SNPs(圖2)，均位于內(nèi)含子區(qū)域，分別為g.757 T>C、g.662 G>A、g. 539 A>G和g. 2216 A>G。利用DNAMAN 5.0對測序結(jié)果比對分析，判定個體基因型(圖2)。其中，g.757 T>C包括CC、CT、TT共3種基因型，g.662 G>A、g. 539 A>G均檢出AA、AG和GG 共3種基因型，g. 2216 A>G在麥洼、類烏齊和申扎牦牛類群存在AA、AG基因型，帕里牦牛和斯布牦牛包含基因型 AA、AG和GG。

圖2 牦牛MyoG 基因 757，662，539，2 216 bp 處堿基變異Fig.2 The bases variation of the MyoG gene at positions 757,662,539，2 216 bp in yak

2.2.3MyoG基因遺傳學(xué)分析 牦牛MyoG基因SNP位點基因型頻率和基因頻率如表5所示。g.757 T>C位點，基因型CT在類烏齊牦牛、申扎牦牛和帕里牦牛類群為優(yōu)勢基因型；TT基因型在麥洼牦牛和斯布牦牛為優(yōu)勢基因型；CC基因型在5個牦牛類群中的分布頻率最低。位點g.662 G>A，雜合基因型AG在類烏齊牦牛、申扎牦牛和帕里牦牛類群分布頻率分別為0.50,0.51和0.65，為優(yōu)勢基因型；GG基因型在麥洼牦牛和斯布牦牛中頻率分別為0.55和0.48，為優(yōu)勢基因型；AA基因型在5個牦牛類群中的分布頻率最低。g. 539 A>G位點AG型在類烏齊牦牛、申扎牦牛和帕里牦牛類群中分布頻率分別為0.50,0.51和0.65；AA在麥洼牦牛和斯布牦牛中為優(yōu)勢基因型。位點g. 2216 A>G，AA型在5個牦牛類群中均為優(yōu)勢基因型。

牦牛MyoG基因SNPs位點的群體遺傳多態(tài)性如表6所示。根據(jù)經(jīng)典多態(tài)信息含量評估模型(PIC<0.25為低度多態(tài)；0.250.50為高度多態(tài))，位點g.757 T>C、g.662 G>A和g. 539 A>G在5個牦牛類群中分布均為中度多態(tài)，遺傳變異較大；位點g. 2216 A>G除了帕里牦牛為中度多態(tài),其余均為低度多態(tài)。在位點g.757 T>C、g.662 G>A和g. 539 A>G中，申扎和帕里牦牛純合度較低，其余純合度均大于0.5；位點g. 2216 A>G純合度較高，說明以上牦牛類群受人工選育程度較低，原始生態(tài)習(xí)性保持良好。χ2適合性檢驗表明，牦牛MyoG基因4個SNPs位點均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，這可能是由于在育種過程中主要采用原始育種方式，人工干預(yù)較少，使其在長期進(jìn)化過程中達(dá)到了群體基因遺傳平衡。

表5 牦牛MyoG基因SNPs位點基因型及基因頻率Tab.5 Gene frequency and genotype frequency of SNPs in MyoG gene

表6 牦牛MyoG基因SNPs位點的遺傳多態(tài)性Tab.6 Genetic polymorphism of SNP sites of MyoG gene in yak

2.2.4MyoG基因多態(tài)性與牦牛生長性能的關(guān)聯(lián)性分析 運(yùn)用SPSS 17.0建立最小二乘線性模型分析MyoG基因多態(tài)位點不同基因型與牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍及體質(zhì)量等生長性狀的相關(guān)性。由表7可知，位點g.757 T>C、g.662 G>A和g. 539 A>G均與體高相關(guān)(P<0.05)。位點g.757 T>C中CC基因型個體體高顯著高于CT基因型和TT基因型，g.662 G>A位點中AA基因型個體體高顯著高于AG和GG型個體，在位點g. 539 A>G中，GG基因型個體體高顯著高于AG基因型和AA基因型。g.2216 A>G與生長性狀不相關(guān)，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但該位點中GG基因型在體斜長和體質(zhì)量指標(biāo)較其他位點有明顯差異，可以作為影響因子進(jìn)行相關(guān)研究。

表7 MyoG基因多態(tài)位點與牦牛生長性狀的關(guān)聯(lián)分析Tab.7 The association analysis the polymorphic locus of MyoG gene and growth traits

3 討論

3.1 不同牦牛類群體尺指標(biāo)比較

生長性狀是畜牧業(yè)生產(chǎn)重要的性狀指標(biāo)，是衡量育種價值及經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)，尋找相關(guān)基因分子標(biāo)記可縮短對生長性狀的選育周期[12]。申扎牦牛體高、體斜長、胸圍、管圍及體質(zhì)量等指標(biāo)均明顯小于麥洼牦牛、類烏齊牦牛和帕里牦牛，這與牦牛所處生態(tài)環(huán)境及氣候條件有關(guān)，不同生態(tài)環(huán)境與草場、植被類型及長勢顯著相關(guān)，也直接影響牦牛的采食量和生長發(fā)育。

類烏齊牦牛分布在西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，海拔高度4 500 m，光照充足，但晝夜溫差大，屬高原溫帶半濕潤性氣候，俗稱“西藏小瑞士”，屬藏東牦牛產(chǎn)業(yè)帶，以牧業(yè)為主，農(nóng)、林相結(jié)合，經(jīng)濟(jì)較為發(fā)達(dá)。類烏齊牦牛肉質(zhì)鮮嫩，膘肥體壯，類烏齊牦牛肉被列為地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，且因其遺傳多樣性豐富，作為遺傳資源通過農(nóng)業(yè)資源委員會鑒定。麥洼牦牛分布于四川省阿壩藏族自治州紅原縣、若爾蓋縣等地，平均海拔3 600 m，太陽輻射強(qiáng)度大且日照時間充足，氣候類型為高原寒溫帶季風(fēng)氣候，是中國草地型優(yōu)良地方品種，是典型乳肉兼用型品種。斯布牦牛以上體尺指標(biāo)與申扎牦牛接近，申扎牦牛主產(chǎn)于那曲地區(qū)申扎縣平均海拔4 450 m，屬高原亞寒帶半干旱季風(fēng)氣候，寒冷干旱[12]，而斯布牦牛主產(chǎn)于拉薩市墨竹工卡縣斯布村，平均海拔4 000 m，屬高原溫帶半干旱季風(fēng)氣候區(qū)，高寒干燥，年溫差小而晝夜溫差大[13]，申扎和斯布牦牛類群在地理條件、生態(tài)環(huán)境較為接近且年降水量稀少導(dǎo)致植被及牧草長勢較差，牧草作為牦牛主要食物來源，直接影響牦牛個體生長發(fā)育。而帕里牦牛產(chǎn)于亞東縣帕里地區(qū)，處于吐蕃南部、喜馬拉雅山脈中段南麓，平均海拔4 640 m，屬高原溫帶季風(fēng)半濕潤氣候，氣溫日差較大，年日照時數(shù)2 663.8 h，降水充沛，物產(chǎn)豐富[14]，使帕里牦牛體高、胸圍和體質(zhì)量指標(biāo)存在一定的優(yōu)勢。5個牦牛類群，公牦牛各項體尺指標(biāo)普遍大于母牦牛，但在斯布牦牛體質(zhì)量指標(biāo)中，母牦牛的體質(zhì)量明顯大于公牦牛，牦牛的生長與氣候及牧草生長情況密切相關(guān)，同時也因選取試驗用牦牛公母數(shù)量差異有關(guān)，存在誤差。

3.2 牦牛MyoG基因多態(tài)性分析

MyoG是重要的成肌調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)水平對肌細(xì)胞生成、融合及肌肉組織生長均產(chǎn)生重要影響，對骨骼肌發(fā)生起重要調(diào)節(jié)作用[15-17]。近年來，許多研究對家畜、家禽MyoG基因多態(tài)位點進(jìn)行挖掘分析，并進(jìn)一步探究SNPs位點與相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)性。趙忠海等[18]利用MyoG和MEF2a基因多態(tài)性聚合效應(yīng)對鴨屠宰性狀的影響進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MyoG基因 g.1131C>T 和 g.2204G>A 突變分別對胸肌率、體質(zhì)量和全凈膛質(zhì)量有顯著影響。楊又兵[19]對豬2個資源家系進(jìn)行RFLP-MspⅠ多態(tài)性掃描，顯示MyoG基因多態(tài)性與豬瘦肉率顯著相關(guān)；朱超杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，草原紅牛MyoG基因外顯子1上SNP位點與體高、體斜長和十字部高均顯著相關(guān)。薛梅等[21]研究認(rèn)為,MyoG基因可作為黃牛體尺性狀標(biāo)記候選基因。韓銀倉等[22]研究表明，MyoG基因?qū)Σ匮蛏L發(fā)育有一定影響。白俊艷等[23]研究表明，MyoG基因外顯子1對羊肉的水分和色澤有影響。欒兆進(jìn)等[16]研究報道,MyoG基因表達(dá)影響綿羊肌內(nèi)脂肪的沉積。研究顯示，MyoG基因不同SNPs位點與家畜和家禽骨骼、肌肉及體尺、產(chǎn)肉質(zhì)量、生長速度及肉品質(zhì)等經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)。目前，對牦牛MyoG基因研究相對較少，僅林亞秋等[24]對九龍牦牛MyoG基因cDNA區(qū)進(jìn)行克隆并在不同組織中進(jìn)行表達(dá)分析。

本研究，共發(fā)現(xiàn)4個SNP位點，均位于內(nèi)含子區(qū)域，這與王敏強(qiáng)等[25]對牦牛、黃牛和水牛MyoG基因外顯子1和5′側(cè)翼區(qū)部分序列研究中，在牦牛該區(qū)域內(nèi)并未檢測到多態(tài)位點的研究結(jié)果一致，說明該基因外顯子區(qū)域較穩(wěn)定；卡方適合性檢驗顯示，4個位點在不同牦牛類群χ2值均符合Hardy-Weinberg平衡，說明牦牛在生長發(fā)育過程中具有相對穩(wěn)定性，但對生產(chǎn)性能的提高有一定阻礙，需適度進(jìn)行人工干預(yù)。在位點g.757 T>C、g.662 G>A和g. 539 A>G中分布均為中度多態(tài)(0.25G除了帕里牦牛為中度多態(tài)外其余均為低度多態(tài)。而在生長性能分析中顯示，類烏齊托牦牛各項體尺指標(biāo)均優(yōu)于其他牦牛類群，也可能與此中度多態(tài)性分布、選擇空間較廣、優(yōu)于品種選育等相關(guān)因素具有一定相關(guān)性。對5個牦牛品種(類群)MyoG基因SNPs不同基因型與體高、體斜長、胸圍、管圍和體質(zhì)量等生長性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，位點g.757 T>C、g.662 G>A和g. 539 A>G均與體高相關(guān)(P<0.05),CC基因型個體的體高顯著高于AC基因型和CC基因型。g.2216A>G與生長性狀不相關(guān)(P>0.05)，其余性狀在各個 SNPs 不同基因型間和性別間差異不顯著。Bhuiyan 等[26]利用PCR-RFLP技術(shù)對7個牛品種 MYRs 家族4個基因外顯子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MyoG基因g.1111C>G 位點對活體質(zhì)量的影響接近顯著(P=0.08)。薛梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，6個黃牛群體MyoG基因多態(tài)性與其體尺性狀相關(guān)。以上試驗結(jié)果與本研究對5個牦牛品種(類群)MyoG基因的研究結(jié)果相近，因?qū)﹃笈yoG基因SNP位點篩查區(qū)域選擇存在差異，造成試驗結(jié)果不同。MyoG基因與體高具有相關(guān)性，可作為體尺性狀標(biāo)記輔助選擇的候選基因。