穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSP72奶牛乳腺上皮細胞系建立與表達鑒定

于文慧，展西振，豐艷妮，曹榮峰，姜忠玲，李華濤，田文儒

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

奶牛乳腺炎主要由病原微生物侵入、化學(xué)物理性損傷及機械性刺激乳房實質(zhì)和/或間質(zhì)而發(fā)病。奶牛乳腺炎發(fā)病率高、治愈率低，嚴(yán)重影響牛奶品質(zhì)和產(chǎn)奶量，甚至危害人類健康[1-2]。

熱休克蛋白(HSP)，也稱為熱應(yīng)激蛋白，通常是機體遭受應(yīng)激而表達，具有高度保守性[3]，其中，誘導(dǎo)表達型熱休克蛋白(HSP72)在調(diào)節(jié)細胞保護、抗凋亡和免疫調(diào)控中具有重要作用[4]。大量人類醫(yī)學(xué)報道，HSP72有明顯的抗炎癥作用[5]。各種因素引起的炎癥反應(yīng)都伴有HSP72的高表達，并且HSP72能阻斷TREM-1的活化[6]，進而解除TREM-1對負調(diào)節(jié)因子IRAK-M和Tollip表達的抑制[7]，有效抑制IL-6、IL-8和TNFα表達[8-10]。LPS可誘導(dǎo)內(nèi)源性負調(diào)控分子HSP72表達，維持細胞內(nèi)免疫應(yīng)答平衡[11]。還有研究證實，誘導(dǎo)內(nèi)源性HSP72高表達，可以減少I-κB的降解和NF-κB的核轉(zhuǎn)錄，從而抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎性因子表達[8]。HSP72能抑制NF-κB的活力，通過細胞內(nèi)NF-κB調(diào)節(jié)機制來參與其應(yīng)激保護作用[9-10]，減輕細胞損傷。重組HSP72能誘導(dǎo)抗炎細胞因子IL-10生成，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[12]。但是，HSP72在奶牛乳腺炎癥免疫應(yīng)答信號通路中的分子調(diào)控機制和轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不完全清楚。因此，建立穩(wěn)定表達HSP72牛乳腺上皮細胞系，可為研究奶牛乳腺炎分子調(diào)控機制以及抗性分子藥物篩選提供新的理論依據(jù)和工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞和慢病毒包裝系統(tǒng)

牛乳腺上皮細胞經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生殖生理與疾病實驗室鑒定并傳至第56代，以含1%雙抗的DMEM/F12加入10% FBS，置入5% CO2、37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；293T細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫；慢病毒包裝系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev和Pvsv-G和重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)成，穿梭質(zhì)粒LV5既能持續(xù)表達目的基因，又能表達嘌呤霉素和綠色熒光蛋白基因，用于細胞篩選，該系統(tǒng)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2 主要試劑

DMEM/F12、胎牛血清FBS、胰酶Trypsin-EDTA Solution及雙抗(青鏈霉素)購自GIBCO公司；Hepes購自AMRESCO公司；RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑購自上海吉瑪公司；聚凝胺和Hochest33342購自Sigma公司；嘌呤霉素和ABC(小鼠IgG)-POD kit試劑盒購自索萊寶公司；HSP72抗體購自Santa cruz公司；二抗購自Jackson ImmunoResearch公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛HSP72基因擴增及產(chǎn)物回收 將<107懸浮細胞分裝于1.5 mL離心管中，根據(jù)組織細胞RNA快速提取試劑盒的說明，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴增HSP72基因。按照牛HSP72引物(GenBank Acc: BC103083)，利用Premier 5.0軟件設(shè)計。上游引物：5′-GAGCTCAAGCTTC ATGGCGAAAAACATGG-3′；下游引物：5′-GGTATCG TCGACATAACCACCTCAATG-3′，上海生工生物工程股份有限公司合成引物。參考李琪等[13]方法將HSP72基因重組到穿梭質(zhì)粒中，構(gòu)建LV5-HSP72表達載體。

1.3.2 慢病毒載體包裝及病毒滴度檢測 將含目的序列HSP72的穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev和Pvsv-G)與300 μL RNAi-Mate按比例共轉(zhuǎn)染293T細胞，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，收集上清，4 000 r/min離心4 min，移取上清，分裝。采用感染滴度測定法檢測病毒滴度，96孔板按4×103個/孔接種293T細胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后吸取10 μL病毒原液，用10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋10倍，設(shè)置3～5個稀釋度，100 μL/孔加至96孔板中，并設(shè)置空白對照孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h；加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，100 μL/孔，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。倒置熒光顯微鏡或FACS計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

1.3.3 慢病毒侵染靶細胞MOI篩選 以1×104個/孔奶牛乳腺上皮細胞接種于24孔板，培養(yǎng)至擬合度約60%，將慢病毒分別以10，20，50，70，100 MOI轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)48 h，于倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，本試驗確定MOI為70。

1.3.4 慢病毒載體轉(zhuǎn)染方法 病毒轉(zhuǎn)染前1 d，以0.5×105個/孔細胞接種至24孔板中，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞擬合度至40%～50%；棄掉原來的培養(yǎng)液，每孔加入還有病毒液的0.4 mL新鮮培養(yǎng)液，最后加入0.5 μL聚凝胺。于24 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；72 h后于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光表達量。

1.3.5 嘌呤霉素濃度的篩選 將25 mg嘌呤霉素溶于25 mL PBS溶液中(濃度為1 mg/mL)；篩選前1 d，以 0.5×105個/孔細胞接種至24孔板中，每孔加入0.5 mL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5%的條件下培養(yǎng)細胞至40%～50%融合；按梯度濃度(0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 μg/mL)加入嘌呤霉素稀釋液，隔1 d更換含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)液(濃度不變)一次，培養(yǎng)3 d，最終確定能使牛乳腺上皮細胞全部死亡的嘌呤霉素濃度為篩選濃度。

1.3.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的篩選 將慢病毒感染后的牛乳腺上皮細胞用2 μg/mL嘌呤霉素溶液進行篩選，每1～2 d更換含嘌呤霉素的新鮮細胞培養(yǎng)液一次，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，篩選14 d，得到穩(wěn)定表達HSP72的牛乳腺上皮細胞。

1.3.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系中HSP72表達的檢測 免疫組化法：收集HSP72慢病毒感染細胞、慢病毒空載體感染細胞和正常未感染細胞，用4%多聚甲醛固定，PBS漂洗，0.5% 曲拉通X-100室溫孵育，3% H2O2處理，5% BSA封閉，滴加稀釋一抗(1∶50)，37 ℃孵育1 h左右，PBS清洗3次，滴加Bio-羊抗小鼠IgG稀釋液(1∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加SABC-POD稀釋液(1∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗4次，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察HSP72表達情況。

Western Blot法：分別提取牛HSP72慢病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒空載體轉(zhuǎn)染和正常未轉(zhuǎn)染3種細胞株總蛋白，用含1%PMSF的細胞裂解液裂解細胞。經(jīng)SDS-PAGE分離后，用半干轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入羊抗牛HSP72(1∶1 000)和兔抗羊IgG-HRP(1∶3 000)孵育，顯色后拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢病毒的滴度值檢測

經(jīng)倒置熒光顯微鏡或FACS計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)，根據(jù)計算公式：病毒滴度(TU/mL)=GFP陽性細胞數(shù)/稀釋倍數(shù)，攜帶HSP72基因的慢病毒滴度約為1.0×109TU/mL?？蛰d體對照慢病毒濃縮后的病毒滴度約為1.0×109TU/mL。

2.2 確定嘌呤霉素的篩選濃度

正常牛乳腺上皮細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選3 d后，嘌呤霉素濃度≥2 μg/mL的孔中牛乳腺上皮細胞全部死亡。因此，嘌呤霉素的最佳篩選濃度為2 μg/mL。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的篩選

感染細胞經(jīng)嘌呤霉素篩選后，在倒置熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光，正常細胞組未轉(zhuǎn)染任何載體，沒有綠色熒光，慢病毒空載體轉(zhuǎn)染細胞組和HSP72慢病毒轉(zhuǎn)染細胞組均可觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達90%以上，慢病毒成功轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞(圖1)。

A,D.正常細胞；B,E.慢病毒空載體轉(zhuǎn)染細胞；C,F.HSP72慢病毒轉(zhuǎn)染細胞。A,D. Normal cells; B,E. Lentiviral empty carrier transfected cells; C,F. HSP72 lentivirus transfected cells.

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細胞中HSP72的鑒定

免疫組化檢測HSP72表達，發(fā)現(xiàn)正常細胞和空載體感染細胞，HSP72呈現(xiàn)低表達(圖2-A、B)，細胞呈現(xiàn)淺棕色，與前2組相比，轉(zhuǎn)染攜帶HSP72目的基因載體細胞，HSP72高表達，呈現(xiàn)顏色較深的棕色，對比差異明顯(圖2-C)。

A.正常細胞；B.慢病毒空載體轉(zhuǎn)染細胞；C.HSP72慢病毒轉(zhuǎn)染細胞。A. Normal cells; B. Lentiviral empty carrier transfected cells; C. HSP72 lentivirus transfected cells.

2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細胞中HSP72的檢測

用Western Blot法檢測HSP72表達發(fā)現(xiàn)(圖3)，3組細胞均表達HSP72，與正常轉(zhuǎn)染細胞相比，慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的細胞HSP72表達稍有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異，而攜帶HSP72基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞HSP72呈現(xiàn)高表達，且差異極顯著(P<0.01)，與慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的細胞相比，攜帶HSP72基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染的細胞HSP72呈現(xiàn)高表達，且差異極顯著(P<0.01)。

A.正常細胞；B.慢病毒空載體轉(zhuǎn)染細胞；C.HSP72慢病毒轉(zhuǎn)染細胞；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激蛋白對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用越來越受到關(guān)注[14]。因為HSP72在正常細胞中很少甚至不表達，當(dāng)細胞受到應(yīng)激時表達增加，所以在目前的國內(nèi)外研究中，HSP72是熱休克蛋白里研究最深入的一種[15]。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激可引起奶牛血漿中HSP72含量升高[16]，而人HSP72與TRAF6結(jié)合可抑制LPS激活的NF-κB信號通路[17-18]，從而抑制細胞炎性因子的表達。研究發(fā)現(xiàn)，未轉(zhuǎn)染的正常細胞在G418篩選時被大量殺死，所以HSP72蛋白顯著升高[19]。本試驗使用嘌呤霉素作為篩選試劑，因為慢病毒載體中含有抗嘌呤霉素的基因，當(dāng)抗嘌呤霉素的基因序列整合進入奶牛乳腺上皮細胞，細胞便會穩(wěn)定表達嘌呤霉素抗性基因，所以感染成功的奶牛乳腺上皮細胞可以通過一定濃度的嘌呤霉素篩選出來，獲得穩(wěn)定表達HSP72的細胞株。

相關(guān)研究證明，綠色熒光蛋白(GFP)性質(zhì)比較穩(wěn)定、熒光強度高，并且對多數(shù)的宿主細胞沒有明顯毒害作用，已經(jīng)被廣泛地用作載體報告基因[20]。含HSP72基因的慢病毒載體質(zhì)粒中包含Negative control序列、HSP72序列、GFP以及嘌呤霉素抗性基因。當(dāng)GFP基因整合進入宿主DNA基因組并表達時，在倒置熒光顯微鏡下會觀察到GFP熒光，而沒有侵染或整合成功的牛乳腺上皮細胞在倒置熒光顯微鏡下不會觀察到GFP熒光。所以，將攜帶HSP72基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染牛乳腺上皮細胞，使用倒置熒光顯微鏡觀察GFP熒光表達情況，以此來確定慢病毒是否侵染成功以及是否獲得穩(wěn)定的細胞系。

確定穩(wěn)定表達HSP72的奶牛乳腺上皮細胞細胞系是否構(gòu)建成功，主要是HSP72是否在細胞中表達以及是否具有活性。通過免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和Western Blot方法對穩(wěn)定表達HSP72的奶牛乳腺上皮細胞系進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的牛乳腺上皮細胞中HSP72表達明顯。本試驗使用的方法解決了目的蛋白表達不穩(wěn)定、蛋白活性鑒定繁復(fù)以及瞬時轉(zhuǎn)染時轉(zhuǎn)染效率低等問題。

綜上所述，本試驗成功構(gòu)建穩(wěn)定表達HSP72的奶牛乳腺上皮細胞系，為進一步研究HSP72在牛乳腺上皮細胞炎癥反應(yīng)通路中的作用奠定了堅實基礎(chǔ)。