miR-181a-5p靶基因預(yù)測(cè)及其在鵝卵泡顆粒層中的表達(dá)分析

莫遠(yuǎn)亮，鄧 艷，王繼文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130 )

microRNA是一組由基因組編碼的長(zhǎng)約22 nt的非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3′UTR堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，并在Argonaute蛋白參與下形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，然后通過阻止其翻譯或降解靶基因mRNA，以調(diào)控靶基因的表達(dá)[1]。研究表明，miR-181a-5p在脊椎動(dòng)物中廣泛存在，可參與多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程。在動(dòng)物成肌細(xì)胞中，miR-181a-5p能夠靶向抑制HOXA11的表達(dá)，進(jìn)而增加成肌分化關(guān)鍵基因MyoD、MyoG、MHC、MCK的表達(dá)，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化[2]。在人的HK-2細(xì)胞中，miR-181a能夠下調(diào)抗凋亡基因BCL2的表達(dá)，上調(diào)促凋亡基因BAX表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。研究表明，miR-181a既可通過沉默HOXA1來抑制原始生殖細(xì)胞的分化，同時(shí)又可通過調(diào)控NR6A1來抑制原始生殖細(xì)胞的增殖[4]。在體外培養(yǎng)的卵巢中，F(xiàn)SH處理可誘導(dǎo)miR-181a的表達(dá)，而LH卻抑制miR-181a的表達(dá)，F(xiàn)SH和LH可能通過類固醇激素和miR-181a所介導(dǎo)的信號(hào)通路來調(diào)控原始生殖細(xì)胞的有絲分裂和減數(shù)分裂[5]。

目前，有關(guān)miR-181a-5p在顆粒細(xì)胞中的功能研究相對(duì)較少，而在禽類顆粒細(xì)胞中尚未見報(bào)道。研究表明，miR-181a可減少人類顆粒細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達(dá)[6]。而小鼠顆粒細(xì)胞中，miR-181a-5p過表達(dá)時(shí)則會(huì)靶向抑制ACVR2A的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致CCND2和PCNA表達(dá)的下調(diào)，最終抑制顆粒細(xì)胞的增殖[7]。基于鵝卵泡顆粒層的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p顆粒層中高表達(dá)，在4～6 mm、8～10 mm、F5 這3個(gè)階段均是差異表達(dá)的，且呈現(xiàn)出表達(dá)上升的趨勢(shì)，而miR-181a-5p對(duì)細(xì)胞的增殖凋亡具有重要作用。由此推測(cè)，miR-181a-5p可能在鵝顆粒細(xì)胞中具有重要的調(diào)控功能。

本研究以多個(gè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源為基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)的方法，利用qPCR技術(shù)探究miR-181a-5p及其靶基因在鵝顆粒細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律，旨在為進(jìn)一步研究其在顆粒細(xì)胞中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用3只健康的、開產(chǎn)時(shí)間和體質(zhì)量基本一致，處于產(chǎn)蛋高峰期的天府肉鵝母系母鵝。放血處死后，迅速取出整個(gè)卵巢，分離出不同直徑大小的卵泡，用游標(biāo)卡尺測(cè)量不同卵泡橫軸直徑后，分離不同階段(2～4 mm、4～6 mm、6～8 mm、8～10 mm、F5、F4、F3、F2、F1)卵泡顆粒細(xì)胞，PBS漂洗3～4次，剪碎后置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

采用RNAiso Plus(TaKaRa)提取鵝卵泡顆粒層組織總RNA，利用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度。cDNA的合成根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒說明書進(jìn)行，合成的cDNA于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 miR-181a-5p的保守性分析

在miRBase[8](http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫中在線檢索各物種的miR-181a-5p成熟體序列，鵝的miR-181a-5p成熟體序列由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水禽育種課題組前期miRNA測(cè)序所得，采用MEGA 7進(jìn)行保守性分析。

1.4 miR-181a-5p靶基因集的建立

利用miRecords_version4[9](http://c1.accurascience.com/)、miRTarBase7.0[10](http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php)、Tarbase8.0[11](http://carolina.imis.athenainnovation.gr/diana_tools/web/index.php?r=tarbasev8/index)數(shù)據(jù)庫中收錄的miR-181a-5p經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的靶基因，結(jié)合最新的相關(guān)文獻(xiàn)，得到試驗(yàn)驗(yàn)證靶基因。為降低靶基因預(yù)測(cè)的假陽性，綜合TragetScan 7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miRanda(http://www.microrna.org/)、DIANA-microT[12](http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index)、miRWALK 2.0[13](http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/) 4個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，得到預(yù)測(cè)靶基因。將收集整理的已驗(yàn)證靶基因和預(yù)測(cè)的靶基因合并，得到miR-181a-5p靶基因集。

1.5 miR-181a-5p靶基因的GO和KEGG富集分析

采用webgestalt 2017[14](http://www.webgestalt.org/option.php)對(duì)miR-181a-5p靶基因集進(jìn)行GO和KEGG分析，對(duì)所得到的富集結(jié)果用R作圖。GO分析采用超幾何檢驗(yàn)計(jì)算P值，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KEGG分析以Fisher Exact Test計(jì)算P值，P<0.05為基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路。

1.6 靶基因互作網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)前面整理得到的miR-181a-5p靶基因集，利用String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，得到靶基因的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系，使用Cytoscape中的MCODE[15]插件篩選其中的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲卸鹊闹匾詫?duì)靶基因進(jìn)行篩選。

1.7 miR-181a-5p及其靶基因在不同階段顆粒層中的表達(dá)分析

利用qPCR分別檢測(cè)miR-181a-5p和部分核心

靶基因在不同階段顆粒層中的表達(dá)，然后運(yùn)用MEV軟件進(jìn)行基因和樣本雙向聚類，繪制基因表達(dá)熱圖。miR-181a-5p檢測(cè)采用莖環(huán)法，所用莖環(huán)引物和qPCR檢測(cè)試劑均由廣州銳博生物科技有限公司提供。miRNA檢測(cè)采用20 μL反應(yīng)體系：2×SYBR Green Mix 10 μL、RT Product 2 μL、Bulge-LoopTMmiRNA Forward Primer 0.8 μL、Bulge-LoopTMReverse Primer 0.8 μL、dH2O 6.4 μL。mRNA檢測(cè)使用25 μL反應(yīng)體系：SYBR?Premix ExTaqⅡ 12.5 μL，dH2O 8.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1.0 μL(10 μmol/L)、Reverse Primer(10 μmol/L)1.0 μL，cDNA 2.0 μL。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s擴(kuò)增，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為55～95 ℃，每5 s增加0.5 ℃，以檢測(cè)引物特異性。所用引物信息如表1所示。

表1 所用引物信息Tab.1 List of used primers

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-181a-5p的保守性分析

通過miRBase對(duì)鵝(Ans)、雞(Gga)、人(Hsa)、小鼠(Mmu)、大鼠(Rno)、大猩猩(Ggo)、牛(Bta)、斑馬魚(Dre)、熱帶爪蟾(Xtr)等多個(gè)物種的miR-181a-5p的成熟體序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p的成熟體序列在各個(gè)物種中高度保守，其2～8位核心的種子序列基本一致，僅在部分物種中3′端的個(gè)別堿基不同(圖1)。

圖1 miR-181a-5p的序列分析Fig.1 Sequence conservation analysis of miR-181a-5p

2.2 miR-181a-5p靶基因集的建立

對(duì)miRecords_version4、miRTarBase、Tarbase 7.0等數(shù)據(jù)庫中收錄的經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的miR-181a-5p靶基因信息，收集整理得到已驗(yàn)證靶基因249個(gè)。綜合TragetScan 7.1、miRanda、miRWalk 2.0、DIANA-microT等在線軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果，選擇4個(gè)軟件均預(yù)測(cè)到的基因，得到60個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因。綜合驗(yàn)證和預(yù)測(cè)靶基因的結(jié)果，得到總數(shù)為296個(gè)的miR-181a-5p靶基因集(圖2)。

圖2 miR-181a-5p靶基因集的建立Fig.2 Construction of the miR-181a-5p target gene set

2.3 miR-181a-5p靶基因的GO和KEGG富集分析

對(duì)miR-181a-5p靶基因的GO富集分析生物學(xué)過程結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p靶基因主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖分化過程，在顯著富集(P<0.05)的前10條Go term中，其中有3條均與細(xì)胞的增殖分化有關(guān)，表明miR-181a-5p的功能主要與細(xì)胞的增殖分化相關(guān)。同時(shí)miR-181a-5p在繁殖結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)形成、多細(xì)胞器官的發(fā)育、生物大分子代謝等過程也具有重要的調(diào)控作用。大部分靶基因均定位于細(xì)胞膜，主要以結(jié)合蛋白的形式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。

表2 miR-181a-5p靶基因的GO分析Tab.2 GO annotation of miR-181a-5p target gene

對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果如圖3所示，發(fā)現(xiàn)主要富集到多種癌癥信號(hào)通路，如乳腺癌、蛋白聚糖癌、肝炎、前列腺癌、膀胱癌等多種疾病，而在顯著富集的20條通路中，除疾病相關(guān)的信號(hào)通路外，還有FOXO、MAPK、mTOR、PI3K-Akt等信號(hào)通路，其中，F(xiàn)OXO為富集最為顯著的信號(hào)通路之一。FOXO家族為一類轉(zhuǎn)錄因子，可通過誘導(dǎo)促凋亡因子來調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡[16]。而MAPK、mTOR、PI3K-Akt等信號(hào)通路均與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡有關(guān)。多數(shù)靶基因均能富集到FOXO信號(hào)通路之中(圖4)，而MAPK、mTOR、PI3K-Akt等信號(hào)通路均與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡相關(guān)，而所富集得到的這些信號(hào)通路之間相互關(guān)聯(lián)、互相影響。由此說明，miR-181a-5p功能的實(shí)現(xiàn)與FOXO、MAPK、mTOR、PI3K-Akt這些信號(hào)通路密切相關(guān)。

圖3 miR-181a-5p靶基因KEGG分析Fig.3 KEGG analysis of miR-181a-5p target gene set

圖4 miR-181a-5p已驗(yàn)證靶基因參與FOXO信號(hào)通路Fig.4 miR-181a-5p validated target genes involved in FOXO signaling pathway

2.4 靶基因功能互作網(wǎng)絡(luò)分析

根據(jù)篩選出的miR-181a-5p靶基因集，利用String數(shù)據(jù)庫得到靶基因的互作關(guān)系，使用Cytoscape中的MCODE插件篩選其中的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)該網(wǎng)絡(luò)拓?fù)渲卸鹊闹匾詫?duì)靶基因進(jìn)行排序。如圖5所示，其中排在前10位的靶基因分別是：VEGFA、MAPK1、FOS、KRAS、HRAS、SIRT1、BCL2、ESR1、PTEN、CDKN1A，而排在前10位的靶基因均為文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因，可能是由于軟件預(yù)測(cè)存在較高的假陽性，但同時(shí)也說明篩選出的靶基因?qū)iR-181a-5p的功能具有重要影響。篩選出來的10個(gè)核心靶基因中，PTEN、SIRT1為FOXO信號(hào)通路的核心成員。SIRT1主要通過去乙酰化調(diào)控相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的活性，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化、凋亡等過程具有重要的調(diào)節(jié)作用[17-18]。CDKN1A是細(xì)胞周期G1期重要的調(diào)控因子，而BCL2是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。MAPK1是MAPK信號(hào)通路的核心基因，對(duì)細(xì)胞的增殖分化具有重要的調(diào)控作用。

圖5 靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 The interaction network of target gene

2.5 miR-181a-5p在不同階段顆粒層中的表達(dá)分析

miR-181a-5p在不同階段顆粒層中的表達(dá)情況如圖6所示，miR-181a-5p在所有階段顆粒層中均有分布，miR-181a-5p在2～4 mm階段表達(dá)最高，而在4～6 mm階段急劇下降，之后在等級(jí)前隨著卵泡直徑的增加，miR-181a-5p表達(dá)呈現(xiàn)出逐漸增加的規(guī)律，且在4～6 mm,8～10 mm、F5這3個(gè)階段呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)。而在進(jìn)入等級(jí)發(fā)育階段后，miR-181a-5p的表達(dá)并未呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律。其中，8～10 mm和F5為等級(jí)前卵泡發(fā)育到等級(jí)卵泡的過渡時(shí)期，極易因顆粒細(xì)胞凋亡而引發(fā)卵泡閉鎖，推測(cè)miR-181a-5p可能參與鵝卵泡顆粒細(xì)胞增殖凋亡過程。

圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Significant differences(P<0.05) are indicated with different lowercase letters in the diagram.

2.6 miR-181a-5p及其靶基因在不同階段顆粒層中的表達(dá)聚類分析

為探究miR-181a-5p及其可能靶基因在不同階段顆粒層中的表達(dá)規(guī)律，對(duì)miR-181a-5p及其靶基因進(jìn)行表達(dá)聚類分析，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，PGR、SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN、SCD聚在一起，而這些基因主要與細(xì)胞的增殖凋亡相關(guān)。miR-181a-5p與ESR1在顆粒層中表達(dá)模式較為相似，而CDKN1A則與其他基因的表達(dá)模式差距較大。miR-181a-5p與其靶基因通常存在負(fù)調(diào)控關(guān)系，理論上而言，在表達(dá)模式上越相近，則為miR-181a-5p的靶基因可能性越低。樣本聚類上，除2～4 mm比較特殊以外，等級(jí)前卵泡3個(gè)階段4～6 mm、6～8 mm、8～10 mm聚為一類，而等級(jí)卵泡5個(gè)階段F5、F4、F3、F2、F1則全部聚在了一起。miR-181a-5p與其靶基因的表達(dá)模式在8～10 mm、F5階段發(fā)生了較大的變化，而8～10 mm和F5為等級(jí)前卵泡發(fā)育到等級(jí)卵泡的過渡時(shí)期，表明miR-181a-5p與其靶基因在卵泡的動(dòng)態(tài)發(fā)育中具有重要調(diào)控作用，可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡調(diào)控卵泡的動(dòng)態(tài)發(fā)育。

圖7 miR-181a-5p及其靶基因表達(dá)聚類分析Fig.7 Cluster analysis of miR-181a-5p and its target genes

3 結(jié)論與討論

本研究通過4個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件取交集得到60個(gè)可能的靶基因，其中有13個(gè)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，而收集整理的已有文獻(xiàn)報(bào)道的靶基因249個(gè)。通過對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)合報(bào)道的靶基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡有重要的調(diào)控功能，同時(shí)在繁殖結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)的發(fā)育中也具有重要作用。靶基因的KEGG分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)靶基因主要富集到FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信號(hào)通路之中。研究表明，在多數(shù)哺乳動(dòng)物中，miRNA更傾向于結(jié)合到保守的mRNA的3′UTR區(qū)域，因此，miRNA的靶基因可能具有一定的保守性[19]。由于miR-181a-5p在多數(shù)脊椎動(dòng)物中高度保守，因而在不同的物種中可能具有相類似的功能，而miR-181a-5p發(fā)揮其功能主要是負(fù)調(diào)控其靶基因來實(shí)現(xiàn)。目前，已有報(bào)道，miR-181a-5p與FOXO、TGF-β、PI3K-Akt、MAPK等信號(hào)通路有關(guān)，主要通過靶向結(jié)合信號(hào)通路相關(guān)基因來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)功能調(diào)控。miR-181a-5p參與FOXO信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在小鼠顆粒細(xì)胞中，miR-181a-5p可增加FOXO1乙酰化，同時(shí)可靶向抑制SIRT1啟動(dòng)顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。PTEN作為FOXO信號(hào)通路的一員，對(duì)卵巢也具有重要調(diào)控功能。在靶向敲除PTEN的小鼠中，可延長(zhǎng)黃體細(xì)胞的生存周期，同時(shí)促進(jìn)排卵[21]。miR-181a-5p可作為一種調(diào)控因子來啟動(dòng)TGF-β信號(hào)通路，在卵巢上皮癌細(xì)胞中，miR-181a-5p可通過靶向抑制SMAD7的功能來調(diào)控TGF-β介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[22]。在小鼠成纖維細(xì)胞中，miR-181a-5p能夠靶向SMAD7和TCF7L2調(diào)節(jié)TGF-β/SMAD信號(hào)通路，最終影響脂肪細(xì)胞的分化形成[23]。研究表明，miR-181a-5p可通過靶向抑制RASSF6，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路，最終抑制胃癌細(xì)胞的增殖[24]。miR-181a-5p可通過MAPK/JNK信號(hào)通路調(diào)控成神經(jīng)細(xì)胞瘤的凋亡和細(xì)胞自噬過程[25]。而在筆者的富集結(jié)果中也同樣富集到了相關(guān)的通路，這些信號(hào)通路廣泛存在多數(shù)細(xì)胞之中，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理過程聯(lián)系密切。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA靶基因在功能方面也有一定的相似性，通過構(gòu)建miRNA調(diào)控的功能模塊，發(fā)現(xiàn)miRNA靶基因傾向于分布在同一功能模塊[26]。通過對(duì)miR-181a-5p靶基因的GO和KEGG發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p主要參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程，而多數(shù)靶基因集中于FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信號(hào)通路之中。研究表明，miR-181a-5p可直接靶向ACVR2A抑制顆粒細(xì)胞的增殖[9]，也可靶向抑制SIRT1啟動(dòng)顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a可抑制孕酮的釋放，而miR-181a-5p能夠與PGR的3′UTR區(qū)域結(jié)合，并抑制其在mRNA和蛋白水平的表達(dá)[27-28]，推測(cè)可能是由于miR-181a-5p抑制顆粒細(xì)胞的增殖分化，進(jìn)而影響孕酮的合成。miR-181a-5p在所有階段顆粒細(xì)胞中均有分布，且在4～6 mm、8～10 mm、F5這3個(gè)階段呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，而在等級(jí)前卵泡中，容易因顆粒細(xì)胞凋亡而引起卵泡閉鎖，8～10 mm和F5為等級(jí)前卵泡發(fā)育到等級(jí)卵泡的過渡時(shí)期，表明miR-181a-5p可能通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡參與卵泡的動(dòng)態(tài)發(fā)育過程。而在對(duì)miR-181a-5p及其靶基因的表達(dá)聚類分析中，也發(fā)現(xiàn)樣品聚類呈現(xiàn)出明顯的階段劃分，基因的表達(dá)模式在8～10 mm和F5階段發(fā)生了較大的改變。而細(xì)胞增殖凋亡相關(guān)的基因SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN聚在了一起，表明顆粒細(xì)胞的增殖凋亡在卵泡的動(dòng)態(tài)發(fā)育過程中是主要的生理變化過程。

綜上所述，miR-181a-5p可能通過靶向結(jié)合SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等基因參與FOXO、MAPK、PI3K-Akt相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖凋亡過程。本試驗(yàn)為后續(xù)深入探究miR-181a-5p在鵝顆粒細(xì)胞中的功能機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，而所預(yù)測(cè)得到的miR-181a-5p可能的靶基因及其信號(hào)通路還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。