煙草中蛋白激酶基因NtCIPK3的表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)分析

陳 倩，楊尚諭，卓 維，李佳皓，彭 雙，王 靜，李立芹

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130；2. 作物科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 611130)

Ca2+是植物細(xì)胞中普遍存在的第二信使，當(dāng)植物受到外界刺激后，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度發(fā)生變化，形成鈣信號。在與鈣傳感蛋白結(jié)合后，能夠?qū)⑩}信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到下游效應(yīng)蛋白，引起植物細(xì)胞的生理生化反應(yīng)，從而參與到植物的生長發(fā)育及脅迫應(yīng)答等過程[1]。類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白CBL(Calcineurin B-like proteins)是其中一類鈣傳感蛋白，能夠高效地與Ca2+結(jié)合，并引起構(gòu)象變化，但該蛋白缺乏其他必要的協(xié)助結(jié)構(gòu)域，因此，其必須與目標(biāo)蛋白CIPK(CBL-interacting protein kinase)結(jié)合形成CBL-CIPK 復(fù)合體才能實(shí)現(xiàn)鈣信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。

CIPK 家族是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[11]，該類蛋白由N-末端激酶結(jié)構(gòu)域和C-末端調(diào)控結(jié)構(gòu)域組成。N-末端行使催化功能，C-末端調(diào)控CIPK的激活功能。同時，C-末端還具有與CBLs相互作用所需的保守NAF/FISL基序，少數(shù)還存在與2C型蛋白磷酸酶(PP2C)互作所需的PPI結(jié)構(gòu)域[12]。CIPK作為細(xì)胞內(nèi)鈣信號系統(tǒng)的一員，在植物逆境應(yīng)答[13]、ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]、營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育過程中具有重要作用[15-16]。

CIPK家族的研究目前主要集中在模式植物和主要農(nóng)作物上，如擬南芥[17]、水稻[18]、玉米[19]。隨著更廣泛的基因組序列研究，CIPK家族已經(jīng)在各種植物的基因組中被分離和鑒定。如在木薯中，共鑒定了CIPK家族中的25個成員[20]，在大豆中發(fā)現(xiàn)52個CIPK家族基因[21]。但是，目前關(guān)于煙草CIPK基因的鑒定和研究較少。

為此，本研究根據(jù)同源克隆的方法，從普通煙草K326中克隆到1個CIPK3基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對序列特征、進(jìn)化規(guī)律等進(jìn)行了分析。同時，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)，對該基因的組織表達(dá)、逆境響應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。并利用雙酶切法成功構(gòu)建了pBI121-NtCIPK3過表達(dá)載體，旨在為進(jìn)一步揭示CIPK3基因在煙草抗性機(jī)制中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試煙草品種為普通煙草品種 K326。采用漂浮育苗的方法進(jìn)行育種，生長60 d后，分別對煙株的根、莖、葉進(jìn)行取樣。待其生長至盛花期，再對花進(jìn)行取樣。所有采集的樣品均需在液氮中速凍1 min后，放置-80 ℃冰箱中以供后續(xù)使用。

將煙草品種K326種子進(jìn)行表面消毒，均勻地布種到MS培養(yǎng)基上，15 d后將幼苗置于不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行試驗(yàn)處理，試驗(yàn)共設(shè)對照(MS培養(yǎng)基，CK)、低鉀處理(含鉀量為10 μmol/L的MS培養(yǎng)基)、模擬干旱(含5% PEG-6000的MS培養(yǎng)基)、鹽脅迫(含200 mmol/L NaCl的MS培養(yǎng)基)、ABA處理(含1 μmol/L ABA的MS培養(yǎng)基)、H2O2處理(含10 mmol/LH2O2的MS培養(yǎng)基)。低溫處理(MS培養(yǎng)基)是將15 d齡的幼苗置于 4 ℃光照培養(yǎng)箱中。上述處理，在處理后0，3，6，12，24 h對煙草幼苗進(jìn)行整株取樣。立即放入液氮中速凍1 min后，保存在-80 ℃冰箱備用。

選用寶生物工程(大連)有限公司的TRIzol試劑、高保真酶、限制性內(nèi)切酶、PrimeScript RT reagent Kit、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master mix等，通用型DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，DH5α大腸桿菌感受態(tài)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，引物合成與測序由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草NtCIPK3基因的克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 參考GenBank收錄的林煙草CIPK3序列(XM_009774691.1)，根據(jù)同源物種的保守區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計引物NtCIPK3-F：5′-TCTAGAAT GAATCGGGCAAAAATCAA-3′(劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn))和NtCIPK3-R：5′-CCCGGGTTATTTTGGA AGTTTAGCCG-3′(劃線部分為SmaⅠ酶切位點(diǎn))。擴(kuò)增體系及程序按文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，對目的基因進(jìn)行克隆。

PCR擴(kuò)增目的片段經(jīng)純化后與過表達(dá)載體pBI121用XbaⅠ和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，在16 ℃下連接過夜，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)，隨后在含有卡那霉素的LB平板上進(jìn)行抗性篩選，挑取陽性單克隆，進(jìn)行菌落PCR檢測驗(yàn)證，并將所對應(yīng)的陽性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.2 煙草NtCIPK3基因生物信息學(xué)分利用Prot Param在線工具分析NtCIPK3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；蛋白同源性比對以及疏水性分析，運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，利用TMHMM Server v. 2.0工具進(jìn)行分析；蛋白保守結(jié)構(gòu)分析，利用NCBI的CDD結(jié)構(gòu)域分析工具；蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，應(yīng)用IBCP的在線工具SOPMA；蛋白的三級結(jié)構(gòu)特性，利用SWISS-MODEL軟件在線預(yù)測，結(jié)果在Ras Top軟件中查看；應(yīng)用在線程序PSORT預(yù)測NtCIPK3的亞細(xì)胞定位；利用NLS Mapper軟件在線預(yù)測該基因的核定位信號；利用Clustal 2.1和MEGA 5軟件，使用鄰近法模式構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，具體參數(shù)設(shè)置見參考文獻(xiàn)[23]。

1.2.3 煙草NtCIPK3基因的表達(dá)分析 根據(jù)NtCIPK3基因測序結(jié)果作為依據(jù)，設(shè)計qRT-PCR引物NtCIPK3-qF：5′-ATGAATCGGGCAAAAATCAAGCGT A-3′和NtCIPK3-qR：5′-CGTTTCTCGCTTGAATCCCT-3′，選用煙草組成型表達(dá)基因18S rRNA作為內(nèi)參，以煙草不同組織和不同處理下的幼苗cDNA為模板，進(jìn)行基因表達(dá)模式分析，內(nèi)參引物序列參照文獻(xiàn)[24]。反應(yīng)程序如下：50 ℃反應(yīng)2 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，65 ℃延伸45 s，共39個循環(huán)。所有的樣品均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，基因的相對表達(dá)水平用2-ΔΔCt方法計算，運(yùn)用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtCIPK3基因的克隆及過表達(dá)載體的構(gòu)建

以煙草總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 000～1 500 bp的位置上有清晰明亮的條帶(圖1-A)，經(jīng)測序結(jié)果顯示，該目的片段長度為1 272 bp，與預(yù)期的目的片段大小相符。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后和pBI121載體分別進(jìn)行雙酶切，將連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取陽性克隆，對連接產(chǎn)物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的條帶(圖1-B)。將篩選出的陽性克隆提取質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示，該目的片段大小為1 272 bp，表明pBI121-NtCIPK3過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

A.NtCIPK3基因PCR產(chǎn)物電泳；B.NtCIPK3基因菌落PCR電泳。M.Marker；1-8.NtCIPK3基因。A. NtCIPK3 PCR product electrophoresis； B.NtCIPK3 gene colony PCR electrophoresis.M.Marker； 1-8.NtCIPK3 gene.

2.2 目的基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1NtCIPK3編碼蛋白的理化性質(zhì)及跨膜結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用ExPASy ProtParamtool軟件，對NtCIPK3蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行在線分析，結(jié)果如表1所示，NtCIPK3蛋白由20種氨基酸組成，共包含423個氨基酸殘基，總的疏水性平均系數(shù)為-0.417。平均疏水系數(shù)小于0，可以預(yù)測該蛋白是親水性蛋白。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)是34.04，說明它是一個穩(wěn)定蛋白。運(yùn)用TMHMM 2.0對目的基因編碼蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果表明(圖2)，該基因所編碼的蛋白在197-214位氨基酸殘基間含有1個跨膜區(qū)，推測NtCIPK3為膜蛋白。

2.2.2 NtCIPK3蛋白的亞細(xì)胞定位、核定位信號及磷酸化位點(diǎn)分析 通過在線PSORT工具，對NtCIPK3蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，定位在細(xì)胞核中的概率為39.1%，在線粒體中的概率為26.1%，在細(xì)胞質(zhì)中的概率為21.7%，分別有4.3%的概率定位于液泡、囊泡分泌系統(tǒng)以及過氧化物酶體。表明NtCIPK3定位于細(xì)胞核的可能性最大。所以，利用NLS Mapper軟件進(jìn)一步分析，在線預(yù)測該基因的核定位信號，在第5和第53個氨基酸之間有雙分型的NLS序列KIKRRVGKYEVGRTIGEGTFAKV KFARNS、EGTFAKVKFARNSETGENVAIKILDKDKVL KHK，說明該蛋白能通過主動轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，初步說明該蛋白是核蛋白。利用NetPhos 3.1 Server在線工具對NtCIPK3蛋白中存在的Ser、Thr和Tyr殘基的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示(圖3)，NtCIPK3中包含15個Ser磷酸化位點(diǎn)、7個Thr磷酸化位點(diǎn)和3個Tyr磷酸化位點(diǎn)。這些氨基酸磷酸化位點(diǎn)可能在維持 NtCIPK 蛋白的空間結(jié)構(gòu)及參與一系列生理生化過程的調(diào)控中起關(guān)鍵作用。

表1 NtCIPK3蛋白理化性質(zhì)分析Tab.1 Analysis of physicochemical properties of NtCIPK3

圖3 NtCIPK3中的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.3 Predicted phosphorylation site in NtCIPK3

2.2.3 NtCIPK3蛋白二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析 運(yùn)用IBCP的在線工具SOPMA對NtCIPK3蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明(圖4-A)，該蛋白所含二級結(jié)構(gòu)單元從高到低依次為α-螺旋37.35%，無規(guī)則卷曲29.79%，延伸鏈20.33%，β-轉(zhuǎn)角所占比例最低為12.53%。由此推測，α-螺旋以及無規(guī)則卷曲是構(gòu)成NtCIPK3蛋白的主要結(jié)構(gòu)，β-折疊含量較少。利用SWISS-MODEL和RasTop在線軟件對NtCIPK3的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示(圖4-B)，該蛋白三級結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，預(yù)示著蛋白功能的復(fù)雜性。

2.2.4 NtCIPK3同源性分析及保守結(jié)構(gòu)域分析 將NtCIPK3氨基酸序列與其他植物中CIPK3蛋白序列進(jìn)行同源性進(jìn)化分析，結(jié)果表明(圖5-A)，NtCIPK3與野生煙草CIPK3、絨毛狀煙草CIPK3、辣椒CIPK3等氨基酸序列同源性較高，分別為99%，99%和96%，與梅花CIPK3的同源性最低，為84%。由圖可知，煙草與馬鈴薯、番茄等聚成一類，而梅花等單獨(dú)一組，NtCIPK3與茄科植物的親緣關(guān)系較近且進(jìn)化同步，表明該基因在物種進(jìn)化中可能較為保守。保守結(jié)構(gòu)域分析表明(圖5-B)，該蛋白的第13-268位氨基酸區(qū)域是蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，其中155-185位氨基酸區(qū)域是激活環(huán)區(qū)域；從288-421位氨基酸區(qū)域是該蛋白的調(diào)控結(jié)構(gòu)域，其中310-331位氨基酸區(qū)域是NAF結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域是CIPK家族蛋白與CBL蛋白相互作用的部位。

A．NtCIPK3蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.NtCIPK3蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。A. NtCIPK3 protein secondary structure prediction； B. NtCIPK3 protein three-dimensional structure prediction.

A.NtCIPK3蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹；B.NtCIPK3蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。A.NtCIPK3 protein phylogenetic tree；B.NtCIPK3 protein conserved domain analysis.

2.3 NtCIPK3的組織表達(dá)分析

通過qRT-PCR技術(shù)，研究該基因在煙草K326品種不同組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖6)，NtCIPK3的表達(dá)量大小依次為葉>莖>根>花，在葉中的表達(dá)量為花中表達(dá)量的6.32倍，根中表達(dá)量的5.61倍，莖中表達(dá)量的3.56倍。表明NtCIPK3基因在煙草的各個組織中均有表達(dá)，但在葉中表達(dá)水平最高，推測可能主要在葉中行使功能。

2.4 逆境脅迫及信號分子處理下NtCIPK3的表達(dá)分析

采用qRT-PCR對NtCIPK3在低鉀(10 μmol/L K+)、5% PEG、NaCl(200 mmol/L)、低溫(4 ℃)處理后，及信號分子H2O2(10 mmol/L)及ABA(1 μmol/L)處理下的表達(dá)動態(tài)進(jìn)行實(shí)時檢測。該基因在低鉀及低溫處理下，3 h表達(dá)量上升至最大，分別為對照(0 h)的2.33倍(圖7-A)和4.27倍(圖7-D)。在PEG和H2O2處理下，都是24 h時表達(dá)量達(dá)到最大，分別為對照(0 h)的15.32倍(圖7-B)和8.37倍(圖7-E)。在NaCl 和ABA處理下，12 h該基因的表達(dá)水平最高，分別為對照(0 h)的4.21倍(圖7-C)和6.22倍(圖7-F)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7同。Different letters indicate significant differences(P<0.05).The same as Fig.7.

圖7 非生物逆境脅迫及信號分子處理下NtCIPK3的表達(dá)分析Fig.7 Expression of NtCIPK3 under abiotic stress and signal molecule processing

3 討論與結(jié)論

鈣離子在植物的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要的作用。鈣離子傳感器，CBLs，能與它們的靶蛋白CIPKs形成蛋白復(fù)合體，共同調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育及響應(yīng)環(huán)境脅迫[25]。大部分CIPK家族的功能研究集中在模式植物，如擬南芥、水稻上，但在煙草中的研究鮮有報道。為此，在本研究中通過同源克隆的方法，從普通煙草品種K326中克隆得到NtCIPK3基因。通過序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，NtCIPK3蛋白包含保守的N末端激酶結(jié)構(gòu)域和C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，這與擬南芥和其他物種的CIPKs的結(jié)構(gòu)特征一致[26]。N-末端催化激酶結(jié)構(gòu)域具有ATP結(jié)合位點(diǎn)和激活環(huán)。C末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域含有介導(dǎo)CIPK和CBL之間相互作用的NAF/FISL基序，以及介導(dǎo)CIPK和2C型蛋白磷酸酶(PP2C)之間的相互作用的PPI基序[27]。通過亞細(xì)胞定位預(yù)測，NtCIPK3蛋白主要定位于細(xì)胞核，這在擬南芥中也有相同發(fā)現(xiàn)，擬南芥CIPK3與ABA抑制子基因ABR1共定位于細(xì)胞核，共同參與ABA信號通路的調(diào)控[10]。

組織表達(dá)分析結(jié)果表明，NtCIPK3基因在選取的各個組織中均有表達(dá)，但各組織間的表達(dá)水平不同，在葉中表達(dá)量最高，莖和根次之，在花中的表達(dá)量最低。葡萄CIPK14基因的組織表達(dá)情況與之相似[28]。暗示這些基因在植物發(fā)育過程中可能發(fā)揮相似的功能。推測在煙草生長過程中，葉是最重要的光合作用器官，NtCIPK3基因的高表達(dá)可能有助于植物快速的營養(yǎng)生長以及響應(yīng)環(huán)境脅迫。但這與大豆中的表達(dá)模式不同，大豆CIPK3在花中表達(dá)量最高[21]。推測是因?yàn)榇蠖古c煙草的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，CIPK 的功能在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了歧化。

qRT-PCR分析結(jié)果表明，在各種非生物逆境脅迫及信號分子處理下，NtCIPK3基因相對表達(dá)水平均出現(xiàn)顯著變化，表明該基因的表達(dá)受各種非生物脅迫因子的影響，推測NtCIPK3基因可能參與植物各種非生物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。在低溫處理下，NtCIPK3基因的表達(dá)在3 h時受到顯著誘導(dǎo)，這與在油菜中CIPK3基因的表達(dá)情況相同[29]。擬南芥中也有相似研究，AtCIPK3基因在低溫響應(yīng)中具有重要作用，可能通過調(diào)控CBF/DREB1轉(zhuǎn)錄因子基因來調(diào)控冷響應(yīng)基因RD29A的表達(dá)[30]。在低鉀和PEG處理下，該基因的表達(dá)水平受到顯著誘導(dǎo)，這在葡萄CIPK3基因的研究中也有相同發(fā)現(xiàn)[31]。在水稻和玉米中也發(fā)現(xiàn)大量 CIPK 基因響應(yīng)PEG、低鉀等脅迫應(yīng)答過程[32-33]。在高鹽處理下，NtCIPK3基因在12 h時表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，這與擬南芥及沙梨中多個CIPK基因在高鹽處理下的表達(dá)模式一致[34-35]。但與玉米CIPK3的表達(dá)模式不完全相同，玉米CIPK3在鹽脅迫下，根中表達(dá)量降低，葉中表達(dá)量升高[33]。這可能是因?yàn)镹tCIPK3基因表達(dá)量檢測的是整株表達(dá)水平，而該基因在葉中表達(dá)量最高，所以，在葉中的表達(dá)情況占主導(dǎo)作用。NtCIPK3在ABA處理下，表達(dá)上調(diào)，這在擬南芥中有相似的研究結(jié)果。擬南芥CIPK3的表達(dá)受ABA誘導(dǎo)，進(jìn)一步的研究表明該基因在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[36]。以上研究為進(jìn)一步探索NtCIPK3蛋白激酶基因的功能及機(jī)制提供了重要的依據(jù)。

根據(jù)同源物種基因的保守性，參考林煙草CIPK3序列設(shè)計引物，從普通煙草K326中克隆到1個蛋白激酶基因NtCIPK3，序列長度為1 272 bp。生物信息學(xué)研究表明，NtCIPK3為堿性親水性蛋白，主要定位于細(xì)胞核。含有CIPK蛋白保守結(jié)構(gòu)域，且具有多個Ser、Thr和Tyr磷酸化位點(diǎn)。qPT-PCR分析結(jié)果表明，NtCIPK3基因在煙草根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但在葉中表達(dá)量最高。NtCIPK3基因在不同時間點(diǎn)的表達(dá)，分別受到低鉀、PEG、ABA、NaCl、H2O2及低溫脅迫的顯著誘導(dǎo)，表明NtCIPK3基因可能在植物多種非生物脅迫應(yīng)答中行使功能。