花生幾丁質(zhì)酶基因的克隆及抗病性驗(yàn)證

郭 悅，姜平平，潘雷雷，周文杰，徐 磊，張茹琴，隋炯明， 郭寶太，王晶珊，喬利仙

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 山東省旱作農(nóng)業(yè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109)

幾丁質(zhì)和葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶通過降解菌絲生長末端新合成的幾丁質(zhì)，破壞菌絲端部生長而使其頂端細(xì)胞壁變薄，繼而發(fā)生球狀突起，最后導(dǎo)致病原體死亡[1]，而且原生質(zhì)膜破裂產(chǎn)生的細(xì)胞碎片具有誘導(dǎo)作用，進(jìn)而刺激寄主植物的抗病反應(yīng)[2]。因此，植物幾丁質(zhì)酶在參與植物抗病反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用，在正常情況下，大多數(shù)高等植物體中所含幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)水平很低，但在病原菌侵染、誘導(dǎo)物處理及各種傷害誘導(dǎo)條件下表達(dá)量顯著提高，如病原菌侵染、至少有31種病原真菌(含變種和?；?可誘導(dǎo)植物幾丁質(zhì)酶，病毒、類病毒[3]、細(xì)菌[4]、真菌、外源幾丁質(zhì)、乙烯、重金屬、鹽溶液、機(jī)械損傷、紫外線輻射、臭氧等因素同樣具有誘導(dǎo)作用[5]。水楊酸(SA)也可以誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，而且植物幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)是有組織特異性的，與植物的發(fā)育有關(guān)。誘導(dǎo)可以發(fā)生在不同的組織器官中，包括胚、種子、子葉、根、莖、葉、花和原生質(zhì)體[6]。

已有研究表明，不同來源的幾丁質(zhì)酶對不同病原菌及害蟲的作用效果不同。一般認(rèn)為，對昆蟲的生防作用以昆蟲病原真菌源和昆蟲源的幾丁質(zhì)酶為好，而有試驗(yàn)表明，一些純化的細(xì)菌和植物幾丁質(zhì)酶對昆蟲影響甚少。對細(xì)菌和真菌的頡抗作用以微生物源的尤其是生防菌本身的幾丁質(zhì)酶基因?yàn)楹肹7]。從轉(zhuǎn)基因作物來源，包括了水稻、小麥、番茄、黃瓜、胡蘿卜、油菜、馬鈴薯、煙草、花生、蘋果、核桃、玫瑰等多種作物，其中以煙草最多[8](原因是它的再生和轉(zhuǎn)化非常容易，它是許多研究者首選的受體植物)。自1991年Broglie等[9]首次報(bào)道轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因的植物抗真菌病以來，已有更多的研究者轉(zhuǎn)向幾丁質(zhì)酶基因的克隆與轉(zhuǎn)移。到1995年底，已有水稻、大麥、煙草等植物的幾丁質(zhì)酶基因被轉(zhuǎn)入水稻、煙草、番茄等植物。Osman等[10]克隆了棉葉蟲的幾丁質(zhì)酶基因，并將其轉(zhuǎn)入到玉米中，轉(zhuǎn)基因玉米對玉米螟的抗性增強(qiáng)。Richa 等[11]從抗水稻紋枯病菌的水稻品種中克隆了1個新的幾丁質(zhì)酶基因，將其轉(zhuǎn)入到對紋枯病敏感的粳稻品系臺北309中，轉(zhuǎn)基因植株對水稻紋枯病菌的抗性增強(qiáng)。Marchant等[12]將水稻Ⅰ類堿性幾丁質(zhì)酶基因?qū)朐耘嗝倒逯?，轉(zhuǎn)基因植株對黑斑病菌的抗性增強(qiáng)。郭林霞等[13]將杜仲的幾丁質(zhì)酶基因EuCHIT1轉(zhuǎn)入到番茄中，接菌灰霉病前轉(zhuǎn)基因番茄的POD活性高于野生型，MDA活性低于野生型；接菌后轉(zhuǎn)基因植株SOD、POD及CAT的活性分別比野生型高19.48%，116.08%，53.80%，MDA含量比野生型低37.65%；說明EuCHIT1基因過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄的抗氧化能力, 對灰霉病的抗性增強(qiáng)。金學(xué)博等[14]從羊草中克隆獲得1種新型幾丁質(zhì)酶基因LcChi2，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功獲得過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻，通過稻瘟病活體接種試驗(yàn)證明了該基因提高了水稻的抗病性。程笑笑[15]通過同源克隆獲得大麗輪枝菌內(nèi)源幾丁質(zhì)酶基因VDECH，并通過原核表達(dá)獲得純化蛋白。VDECH蛋白能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生初級免疫反應(yīng)，引起擬南芥和棉花葉片過敏性反應(yīng)，上調(diào)擬南芥和棉花防御相關(guān)基因的表達(dá)，顯著提高對主要病原菌棉花黃萎病菌的抗性。

花生在生產(chǎn)過程中同樣容易感染網(wǎng)斑病、黑斑病、銹病、黃曲霉菌等真菌性病害，嚴(yán)重影響著花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，通過遺傳工程手段提高花生的抗病性，便成為花生抗病遺傳改良的有效途徑。

本研究擬在花生中克隆幾丁質(zhì)酶基因，并通過遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證其功能，創(chuàng)制抗病花生新材料，旨在為花生抗病育種提供新的基因源及新型抗病種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生(ArachishypogaeaL.)品種花育23和魯花14，質(zhì)粒pCANBIA1301，大腸桿菌DH5α菌株和農(nóng)桿菌EHA105菌株，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)花生研究中心保存；克隆載體pMD18-TSimpleVector、限制性內(nèi)切酶及RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS-B5(MS 無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分)+10 mg/L 2,4-D；體胚萌發(fā)培養(yǎng)基：MS-B5(MS無機(jī)鹽+B5有機(jī)成分)+4 mg/L 6-BAP[16]。

1.2.2 花生生長及處理 將花生品種花育23的種子用次氯酸鈉表面消毒15 min，然后接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行催芽，培養(yǎng)室溫度為23～25 ℃，光照強(qiáng)度40.5 μmol/(m2·s)，每日光照時間13 h。當(dāng)幼苗長到16 d時，使用1.5 mmol/L的水楊酸噴施葉片表面處理48 h后取樣速凍，用于RNA的提取。

1.2.3 DNA提取、RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 當(dāng)幼苗長到16 d時，摘取花生尚未完全展開的嫩葉50～100 mg，迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織成粉末狀，利用CTAB法提取基因組DNA；利用RNA iso TM Plus法(TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit)，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行RNA提取。利用寶生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Prime scrip TMR Treagent bKit)，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第1條鏈，進(jìn)一步合成雙鏈cDNA備用。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 依據(jù)GenBank公布的花生Chi2.2(classII)基因序列(GenBank登錄號X82330)，設(shè)計(jì)1對特異性引物P1和P2，在P1的5′ 端引入BglⅡ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)，P2的5′端引入BstEⅡ酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。引物序列分別為P1:5′-AGATCTGGTACATCCCAAACTCAA-3′；P2:5′-GGTNACCCGCTATACTGGCTACTGCT-3′。引物由大連寶生物公司(TaKaRa)合成。

1.2.5 PCR擴(kuò)增及RT-PCR擴(kuò)增 分別以花生品種花育23的DNA和cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR總反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板(30 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，10× PCR Buffer 4 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，TaqE(5 U/μL)0.5 μL，ddH2O 14.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收，連接pMD18-T克隆并測序。

1.2.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pMD18T-Ah-Chi經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅡ和BstEⅡ酶切，回收Ah-Chi小片段。pCAMBIA1301經(jīng)同樣限制酶酶切切掉Gus基因，回收大片段，與Ah-Chi小片段連接獲得重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-Ah-Chi(圖1)。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及BglⅡ和BstEⅡ雙酶切驗(yàn)證。重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-Ah-Chi通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105獲得重組菌株。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-Ah-Chi的構(gòu)建過程(Gus基因被Ah-Chi 基因替換)Fig.1 Construction of recombinant plasmid pCAMBIA1301-Ah-Chi (Gus was substituted for Ah-Chi)

1.2.7 花生遺傳轉(zhuǎn)化 剝?nèi)』ㄉ贩N魯花14成熟種子的胚小葉作為外植體，在 70% 乙醇中浸泡 10～20 s，0.1% 升汞中浸泡 8 min，無菌水沖洗3次。將胚小葉外植體接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4 d，然后浸于EHA105農(nóng)桿菌菌液(OD600=0.6～0.8)中，28 ℃，90 r/min振蕩侵染15 min。用無菌濾紙將胚小葉表面殘留菌液吸干后，再接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d。然后轉(zhuǎn)移外植體到體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d，再將誘導(dǎo)得到的體胚轉(zhuǎn)移到體胚伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3個月，期間需要繼代培養(yǎng)2～3次，用15 mg/L的潮霉素進(jìn)行抗性篩選[16]。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測 抗性再生植株利用PCR擴(kuò)增法進(jìn)行分子檢測及篩選，所用引物為35S啟動子序列引物：P3: 5′-GCTCCTACAAATGC CATCA-3′；P4: 5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3′, 擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為195 bp。提取轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓闞NA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，利用RT-PCR分析Ah-Chi的表達(dá)量，以花生肌動蛋白基因Ah-Actin作為內(nèi)參基因，其擴(kuò)增引物序列為：P5: 5′-GTGGCCGTACAACTGGTATTGT-3′, P6: 5′-ATGGAT GGCTGGAAGAGAACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為380 bp，引物由大連寶生物公司(TaKaRa)合成。

1.2.9 轉(zhuǎn)基因植株抗病性驗(yàn)證 抗病性鑒定參照Huynh等[17]的方法，將黑斑病菌(Cercosporidium

personatum)接種于試管斜面PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)至菌絲在培養(yǎng)基上長滿，然后將其轉(zhuǎn)接于PDA平板培養(yǎng)基上，每個平板上放置3塊帶有霉菌的PDA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取轉(zhuǎn)基因植株及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓觏敹碎L勢良好且大小一致的葉片，用70% 酒精表面殺菌后放置在底部鋪有濾紙的滅菌培養(yǎng)皿中，其中葉片基部用沾無菌水的滅菌棉花包裹以保持花生葉片的活力。從培養(yǎng)黑斑病菌的PDA培養(yǎng)基上用打孔器取直徑為6 mm 的菌塊放置于葉片的中央(有菌絲的一面緊貼葉片表面)，每個葉片接種1個菌餅，28 ℃密封培養(yǎng)7 d后觀察葉片感染區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生幾丁質(zhì)酶基因的克隆

以花生品種花育23基因組DNA為模板擴(kuò)增獲得1 779 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2-A)；以cDNA為模板通過RT-PCR獲得1條795 bp的片段(圖2-B)。序列比對結(jié)果表明，該基因包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，符合 “GT……AG”剪切規(guī)則，cDNA序列全長795 bp，編碼265個氨基酸。與GenBank中已注冊序列X82330同源性為100%，該序列已在GenBank上注冊登記(登錄號HQ439775)。

A.以DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B.以cDNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M.DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1, 4.未加模板對照；2-3.DNA模板；5-6.cDNA模板。A.PCR amplification products with DNA as template; B.PCR amplification products with cDNA as template；M.DNA Marker DL2000; 1, 4. Control without DNA template; 2-3.DNA templates; 5-6.cDNA templates.

2.2 花生幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)化樹分析

通過NCBI在線進(jìn)行BlastP比對，發(fā)現(xiàn)Ah-Chi編碼產(chǎn)物與花生幾丁質(zhì)酶基因X82330編碼蛋白同源關(guān)系100%，與水稻(CAA39535.1)、玉米(ALP46629.1)、苜蓿(ABX90065.1)、大豆(XP014618309.1)和擬南芥(NP181885.1)的相關(guān)蛋白的同源性分別達(dá)到83%，83%，72%，58%，49%(圖3-A)；氨基酸序列的多重比較結(jié)果顯示，這些幾丁質(zhì)酶基因編碼產(chǎn)物之間具有較高的保守性(圖3-B)；Ah-Chi與花生野生種(Arachisduranensis,XP_015963545.1)和(Arachisipaensis,XP_016201396.1)編碼的27 ku的酸性內(nèi)切幾丁質(zhì)酶同源性分別為100%，98%，含有保守蛋白結(jié)構(gòu)域chitinase_glyco_hydro_19，該結(jié)構(gòu)域中包括約50個氨基酸的催化位點(diǎn)和60個氨基酸的糖結(jié)合位點(diǎn)(圖3-C)。

2.3 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及花生遺傳轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建的過表達(dá)載體pCAMBIA1301-Ah-Chi通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105獲得重組菌株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化魯花14胚小葉外植體，胚小葉外植體在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)28 d后，大部分將褐化死亡，只得到小部分抗性體胚(圖4-A、B)，將抗性體胚轉(zhuǎn)移到體胚伸長培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35～42 d后體胚明顯伸長，長出葉片(圖4-C)。繼續(xù)培養(yǎng)21～28 d后可得約4～5 cm高的小苗(圖4-D)，將小苗從基部切下，利用嫁接法將再生植株移栽田間[18-19]。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，采用35S引物對基因組DNA及pCAMBIA1301-Ah-Chi質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖5-A所示，1號未加模板對照與3號非轉(zhuǎn)基因植株均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，4-8號轉(zhuǎn)化植株均擴(kuò)增得到了195 bp左右的目的條帶，與2號pCAMBIA1301-Ah-Chi質(zhì)粒陽性對照擴(kuò)增出的片段長度一致，說明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入花生。RT-PCR結(jié)果表明，1號未加模板對照未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶；2號非轉(zhuǎn)基因植株與3-5號轉(zhuǎn)基因植株均擴(kuò)增出Ah-Actin亮度一致的條帶；對于Ah-Chi基因，2號非轉(zhuǎn)基因植株的擴(kuò)增條帶明顯比3-5號轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增條帶弱得多。說明轉(zhuǎn)基因植株中的Ah-Chi得到了過量表達(dá)(5-B)。

A.花生及其他高等植物幾丁質(zhì)酶蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹；B.花生及其他高等植物幾丁質(zhì)酶蛋白序列比對結(jié)果；C.花生幾丁質(zhì)酶保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。A.Phylogenetic tree of chitinase protein in peanut and other higher plants；B.Amino acid alignment of chitinase proteins in peanut and other higher plants;C.Chitinase conservative domain in peanut.

A～B.抗性體胚；C.經(jīng)伸長培養(yǎng)35～42 d的體胚小苗；D.抗性植株。A-B.Resistant somatic embryos；C.Somatic embryo seedlings that had been elongated for 35-42 days；D.Resistant plants.

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定

經(jīng)黑斑病菌(Cercosporidiumpersonatum)接種處理轉(zhuǎn)基因陽性植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓觌x體葉片7 d后，發(fā)現(xiàn)非轉(zhuǎn)基因植株葉片褐化及壞死程度較為嚴(yán)重(圖6-A)，病斑平均直徑為3.5 mm，而2個轉(zhuǎn)基因植株葉片褐化及壞死程度相對較輕(圖6-B、C)，病斑平均直徑為2.8 mm。初步說明轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因的植株抗病性有所提高。

A.35S引物擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因花生植株：M.DL2000；1.未加模板對照；2.pCAMBIA1301-Ah-Chi質(zhì)粒；3.非轉(zhuǎn)基因植株；4-8.轉(zhuǎn)基因植株；B.RT-PCR擴(kuò)增檢測Ah-Chi基因表達(dá)量：M.DL2000；1.未加模板對照；2.非轉(zhuǎn)基因植株；3-5.轉(zhuǎn)基因植株。

3 討論

幾丁質(zhì)酶是重要的病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)，在植物抵御真菌性病害中發(fā)揮重要作用，是植物抗病基因工程的主要研究對象。Cuero等[20]發(fā)現(xiàn)，能產(chǎn)毒的黃曲霉菌可誘導(dǎo)萌芽狀態(tài)的花生種子產(chǎn)生分子量約36～45 ku的幾丁質(zhì)酶，因此，確定花生幾丁質(zhì)酶與黃曲霉、葉斑病之間有一定的相關(guān)性[21]。Prasad等[22]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因Rchit轉(zhuǎn)化3個花生品種獲得30個轉(zhuǎn)基因事件，轉(zhuǎn)基因植株葉片幾丁質(zhì)酶活性比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗岣?～14倍，其中來自于2個轉(zhuǎn)化事件的3個株系對晚斑病、銹病和黃曲霉病的抗性明顯增強(qiáng)。Iqbal等[23]將水稻幾丁質(zhì)酶基因Rchit-3轉(zhuǎn)化到花生子葉中，通過離體培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)基因植株T0，T1植株進(jìn)行褐斑病(Cercosporaarachidicola)抗性測試，轉(zhuǎn)基因植株的抗病性明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。Qiao等[24]研究表明，過量表達(dá)花生β-1,3-葡聚糖基因(Ah-Glu)的轉(zhuǎn)基因植株對褐斑病菌的抗病性增強(qiáng)。幾丁質(zhì)酶基因在植物體內(nèi)以多基因家族的形式存在，Herget等[25]從花生培養(yǎng)細(xì)胞中分離出Chit1～4，并研究證實(shí)Chit2 能夠被病原菌強(qiáng)烈誘導(dǎo)。本研究結(jié)果也表明，表達(dá)花生Ah-Chi的轉(zhuǎn)基因植株對黑斑病菌的抗病性增強(qiáng)。幾丁質(zhì)和葡聚糖都是真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶在抵御植物真菌性病害中具有協(xié)同效應(yīng)[26]。后續(xù)研究中可將幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶這2個基因共同轉(zhuǎn)化來發(fā)揮這2個蛋白的協(xié)同作用，獲得高抗病性的轉(zhuǎn)基因植株以便更好地利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來增強(qiáng)花生對真菌病害的抵抗能力。

花生屬于較難轉(zhuǎn)化的植物，本研究利用丁霄等[16]建立的高效花生再生體系，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，通過體胚發(fā)生途徑誘導(dǎo)植株再生，得到的再生植株來源于單個細(xì)胞，與傳統(tǒng)的器官發(fā)生途徑相比較，避免了再生植株是嵌合體的弊端。花生組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化中遇到的另外一個問題是根的再生比較困難而且生根質(zhì)量較差，移栽難以成活，本研究利用郝世俊等[18]、宋汝濤等[19]發(fā)明的嫁接技術(shù)將再生苗移栽田間，大大提高了再生苗的存活率。而Iqbal等[23]利用巴基斯坦當(dāng)?shù)鼗ㄉ贩NGOLDEN and BARI-2000進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在添加了0.5 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出較為健壯的根，這表明不同基因型的花生品種存在著生根難易的區(qū)別，花生再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

本研究結(jié)果表明，利用遺傳轉(zhuǎn)化方法在花生中過量表達(dá)自身抗病基因提高花生的抗病性是可行的，后期將結(jié)合田間試驗(yàn)對這些轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)，為將來在政策允許條件下的田間釋放提供依據(jù)。另外，與近年所提出的聚合育種相比，單一基因轉(zhuǎn)移對作物的改良存在一定的局限性，如能將幾種抗病基因同時轉(zhuǎn)移至受體，獲得對多種病害免疫或者高抗的特殊材料，或者轉(zhuǎn)入不同來源及不同功能的基因?qū)Χ鄠€農(nóng)藝性狀進(jìn)行改良，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多抗的植物新材料、新品種，這些相關(guān)工作的有效展開將大大提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的效率。