不同中藥提取物的免疫調(diào)節(jié)作用比較

楊海峰， 陳曉蘭， 邱樹磊， 武彩紅， 奚兆壽

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

近年來(lái)，在畜牧業(yè)中普遍存在著接種疫苗后仍然發(fā)生該病的流行，而雞群處于免疫抑制狀態(tài)是導(dǎo)致免疫失敗的重要原因[1]。要解決這一問題，就必須采取有效手段，激活免疫系統(tǒng)，使畜禽機(jī)體接種疫苗后能夠獲得較高水平的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和黏膜免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力。中藥免疫增強(qiáng)劑因無(wú)公害、殘留少、毒副作用小、藥源廣泛、便于應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)日益受到人們的關(guān)注[2]。

我國(guó)為世界上桑葉主要生產(chǎn)國(guó)之一，桑葉藥材的資源尤為豐富，桑葉中營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體必需的氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、黃酮、生物堿等多種成分[3]。現(xiàn)代藥理證明桑葉具有多種藥理活性，如降血脂、降血糖、降血壓、抗衰老、抗腫瘤、抗菌等[4]，桑葉多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[5]。杜仲屬于杜仲科植物，為中國(guó)特有的植物物種，亦為世界寶貴的藥源植物資源，具有延緩衰老、調(diào)血脂血壓、抗菌、抗病毒、抑制腫瘤等藥理作用[6]。同時(shí)研究顯示，杜仲葉醇提取物[7]、杜仲葉浸提物[8]、杜仲葉多糖[9]、杜仲葉粉[10]均具有一定的增強(qiáng)免疫作用。

本研究以桑葉、杜仲、杜仲葉為原藥材，制備桑葉水提物(MLAE)、桑葉粗多糖(MLCP)、杜仲水提物(EUAE)、杜仲葉水提物(EULAE)、杜仲葉粗多糖(EULCP)，研究不同中藥提取物在不同給藥劑量下對(duì)雞新城疫疫苗血清抗體水平的影響，獲得系統(tǒng)免疫效果最佳中藥提取物及其給藥劑量。在此基礎(chǔ)上，研究最佳的中藥提取物對(duì)免疫新城疫疫苗雞呼吸道和腸道黏膜免疫功能的影響，綜合評(píng)價(jià)開發(fā)為免疫增強(qiáng)劑的可能性。本研究對(duì)于充分利用現(xiàn)有的豐富天然資源，盡可能發(fā)揮天然藥物的藥用性能具有顯著的研究?jī)r(jià)值，同時(shí)為篩選新型中藥免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新城疫Ⅳ系苗(La Sota株)，購(gòu)于青島易邦生物工程有限公司，批號(hào)(140325001)；新城疫檢測(cè)抗原，購(gòu)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所；96孔微量血凝板，購(gòu)于南通理能實(shí)驗(yàn)器材有限公司；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)于上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；高速離心機(jī)：BIOFUGE PRIMO R，購(gòu)于Thermo公司；電子天平，F(xiàn)A1104N型，購(gòu)于上海精密科學(xué)儀器有限公司。IgA酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海朗頓生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

時(shí)間：2015年7—12月；地點(diǎn)：江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科技樓。

1.3 藥物準(zhǔn)備

桑葉，購(gòu)于黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)D5090101；鹽杜仲，購(gòu)于黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)D5010301；杜仲葉，購(gòu)于安徽亳州，批號(hào)20150314；芪黃素，購(gòu)于艾迪森(北京)生物科技有限公司，批號(hào)1402253。

1.3.1 桑葉水提物 取桑葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4層紗布濾過(guò)，藥渣同法煎煮和濾過(guò)，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續(xù)濃縮為浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.2 桑葉粗多糖 取桑葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮 2 h，4層紗布濾過(guò)，藥渣同法煎煮和濾過(guò)，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量為75%，靜置24 h，棄上液，沉淀60 ℃干燥，即得桑葉粗多糖。

1.3.3 杜仲水提物 取杜仲藥材500 g，加10倍量水，煎煮1.5 h，4層紗布濾過(guò)，藥渣加等量水，再煎煮1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續(xù)濃縮至浸膏，60 ℃干燥即得。

1.3.4 杜仲葉水提物 取杜仲葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4層紗布濾過(guò)，藥渣同法煎煮和濾過(guò)，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液繼續(xù)濃縮為浸膏，后60 ℃干燥即得。

1.3.5 杜仲葉粗多糖 取杜仲葉藥材500 g，加20倍量水，煎煮2 h，4層紗布濾過(guò)，藥渣同法煎煮和濾過(guò)，合并濾液。濃縮至500 mL，3 000 r/min離心10 min，去除沉淀，上液加95%乙醇至含醇量為75%，靜置24 h，棄上液，沉淀60 ℃干燥，即得杜仲葉粗多糖。

1.4 動(dòng)物分組與處理

試驗(yàn)Ⅰ：1日齡非免疫健康雛雞，飼養(yǎng)至14 日齡時(shí)，檢測(cè)血清新城疫母源抗體效價(jià)，當(dāng)?shù)陀?log2時(shí)正式試驗(yàn)。選擇660羽隨機(jī)均分為33組，每組20羽。分別為桑葉水提物、桑葉粗多糖、杜仲水提物、杜仲葉水提物、杜仲葉多糖大組及芪黃素藥物對(duì)照組、免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組，每大組設(shè)計(jì)2、4、8、12、16、24 mg(以總多糖含量計(jì))6個(gè)劑量組。除空白對(duì)照組外，各組均采用NDV-IV疫苗滴鼻點(diǎn)眼免疫，1羽份/羽，28日齡進(jìn)行二免。各給藥組于每次免疫前3 d開始給藥，連用7 d。給藥劑量為2、4、8、12、16、24 mg/羽(以多糖含量計(jì))相應(yīng)中藥提取物，均拌料給藥。藥物對(duì)照組芪黃素依據(jù)用藥說(shuō)明給藥；免疫對(duì)照組(VC)和空白對(duì)照組(BC)不加任何藥物。

試驗(yàn)Ⅱ：1日齡非免疫健康白羽蛋雞，飼喂商品化飼料(購(gòu)于泰州正大飼料有限公司)，自由飲水。雛雞飼養(yǎng)至14日齡時(shí)，取240羽隨機(jī)均分為6組，除空白對(duì)照組外均用NDV-IV系疫苗滴鼻點(diǎn)眼免疫，28日齡二免。在每次免疫的前3 d，桑葉粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)劑量組每羽分別飲服MLCP 8、4、2 mg(以桑葉粗多糖計(jì))，連用7 d；藥物對(duì)照組芪黃素依據(jù)用藥說(shuō)明給藥；免疫對(duì)照組(VC)和空白對(duì)照組(BC)不加任何藥物。分別于首免后7、14、21、28 d，每組隨機(jī)抽取6羽，測(cè)定氣管和空腸洗液中sIgA含量。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 不同中藥提取物對(duì)雞ND血清抗體效價(jià)的影響 “試驗(yàn)Ⅰ”分別于首免后7、14、21、28 d，各組隨機(jī)抽取10羽進(jìn)行雞翼靜脈采血，采用血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血清新城疫抗體效價(jià)。

1.5.2 MLCP對(duì)雞呼吸道和小腸黏膜免疫功能的影響 分別于首免后7、14、21、28 d，從桑葉粗多糖的高(MLCPH)、中(MLCPM)、低(MLCPL)劑量組及芪黃素對(duì)照組、免疫對(duì)照組(VC)和空白對(duì)照組(BC)隨機(jī)抽取6羽雞，用CO2安樂死，切取長(zhǎng)約5 cm氣管、空腸腸管，用止血鉗夾住氣管和腸管兩端，注射器注入含0.1%牛血清白蛋白和蛋白酶抑制劑的冰浴PBS溶液0.5 mL，將溶液在腸管內(nèi)充分?jǐn)D壓混勻3次后，收集所有腸洗液，4 ℃ 8 000 r/min離心10 min，收集上清液，-70 ℃ 保存，采樣全部完成后同時(shí)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定洗液中sIgA的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重分析，比較各組血清ND抗體效價(jià)、氣管和空腸sIgA的含量，采用Graphpad Prism 5軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床體征觀察

試驗(yàn)期間至結(jié)束，各給藥組雞精神狀態(tài)、采食、飲水均正常且生長(zhǎng)良好。

2.2 血清抗體效價(jià)的變化

2.2.1 桑葉水提物對(duì)ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。首免后7 d，8 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于16、24 mg組和VC組(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后14 d，12 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于除2、4 mg劑量組和芪黃素對(duì)照組外的其余各組(P<0.05)；首免后21 d，12 mg劑量組抗體效價(jià)依然最高，顯著高于16 mg和VC組(P<0.05)，與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后28 d，各給藥組間無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖1)。

2.2.2 桑葉粗多糖對(duì)ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。首免后7 d，4 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于12 mg組和VC組(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后14 d，4 mg劑量組和芪黃素對(duì)照組抗體效價(jià)最高，與2 mg劑量組和免疫對(duì)照組差異顯著(P<0.05)，但與其他給藥組比較差異不明顯(P>0.05)；首免后21 d，2 mg劑量組抗體效價(jià)依然最高，顯著高于除 12 mg、芪黃素對(duì)照組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，8、12 mg組抗體效價(jià)最高，顯著高于除2、16 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)(圖2)。

2.2.3 杜仲水提物對(duì)ND血清抗體水平的影響 首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。首免后7 d，芪黃素對(duì)照組抗體效價(jià)最高，顯著高于除4 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后14 d，2 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于除24 mg劑量組和芪黃素對(duì)照組外的其余各組(P<0.05)；首免后21 d，12 mg 劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于16 mg劑量組和免疫對(duì)照組(P<0.05)，與其他給藥組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；首免后28 d，2 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于除24 mg和芪黃素對(duì)照組外的其余各組(P<0.05)(圖3)。

2.2.4 杜仲葉水提物對(duì)ND血清抗體水平的影響 在首免后7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。首免后7 d，芪黃素對(duì)照組抗體效價(jià)最高，顯著高于除4、8 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后14 d，8 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于免疫對(duì)照組(P<0.05)，但各給藥組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；首免后21 d，4 mg劑量組和芪黃素對(duì)照組抗體效價(jià)最高，顯著高于除2 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，16、24 mg劑量組抗體效價(jià)最高，顯著高于其余各組(P<0.05)(圖4)。

2.2.5 杜仲葉粗多糖對(duì)ND血清抗體水平的影響 首免后 7～28 d，所有給藥組和VC組新城疫血清抗體效價(jià)均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。首免后7 d，各給藥組與免疫對(duì)照組間無(wú)明顯差異(P>0.05)；首免后14 d，各給藥組顯著高于免疫對(duì)照組(P<0.05)，但各給藥組間無(wú)明顯差異(P>0.05)；首免后21 d，芪黃素對(duì)照組抗體效價(jià)最高，顯著高于除24 mg劑量組外的其余各組(P<0.05)；首免后28 d，各給藥組與免疫對(duì)照組及給藥組間均無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖5)。

2.3 桑葉粗多糖對(duì)氣管黏膜sIgA分泌的影響

由表1可知，7 d桑葉粗多糖各組氣管洗液中sIgA濃度高于免疫對(duì)照、空白對(duì)照組，但差異不明顯(P>0.05)。14、21 d桑葉粗多糖高、中劑量組氣管洗液中sIgA濃度高于其余各組，與免疫對(duì)照組和空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。28 d 桑葉粗多糖高、中劑量組和芪黃素對(duì)照組氣管洗液中sIgA濃度顯著高于其余各組(P<0.05)。

2.4 桑葉粗多糖對(duì)空腸黏膜sIgA分泌的影響

由表2可知，7 d桑葉粗多糖各組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于芪黃素對(duì)照、免疫對(duì)照、空白對(duì)照組(P<0.05)。14 d 桑葉粗多糖中劑量組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于除高、低劑量組外的其余各組(P<0.05)。21 d桑葉粗多糖3個(gè)劑量組空腸洗液中sIgA濃度顯著高于除芪黃素對(duì)照組外的其余各組(P<0.05)。28 d桑葉粗多糖各組和芪黃素對(duì)照組氣管洗液中sIgA濃度顯著高于免疫對(duì)照和空白對(duì)照組(P<0.05)，但桑葉粗多糖各組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。

表1 各組氣管洗液中sIgA含量(n=6)

注：同列數(shù)據(jù)后不相同字母者差異顯著(P<0.05)。下表同。

表2 各組空腸洗液中sIgA含量(n=6)

3 討論

3.1 不同中藥提取物對(duì)新城疫血清抗體水平的影響

動(dòng)物機(jī)體的體液免疫應(yīng)答是由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的，通過(guò)對(duì)抗原的識(shí)別、活化、增殖，后分化為漿細(xì)胞并分泌抗體[11]。體液免疫應(yīng)答是清除細(xì)胞外病原體最重要的途徑[12]，因此血清特異性抗體水平的高低可作為評(píng)估機(jī)體體液免疫功能的重要指標(biāo)之一[13]。

中藥提取物由原材料或飲片應(yīng)用科學(xué)的方法進(jìn)行提取、分離、純化制得，以更明確有效的成分、穩(wěn)定可控的質(zhì)量、治療疾病的有效性等優(yōu)勢(shì)被廣泛研究[14-15]。如黃芪多糖、淫羊藿多糖、峰膠黃酮、人參皂苷等中藥成分可顯著促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清ND抗體效價(jià)[16]；中藥九節(jié)茶可以改善應(yīng)激負(fù)荷小鼠淋巴細(xì)胞數(shù)目及淋巴細(xì)胞亞群比例[17]。中藥提取物對(duì)免疫細(xì)胞的刺激作用及對(duì)血清特異性抗體產(chǎn)生水平的影響常作為評(píng)價(jià)其是否具有免疫增強(qiáng)或免疫抑制作用的指標(biāo)。

本研究比較桑葉、杜仲、杜仲葉不同提取物在不同給藥劑量下對(duì)ND疫苗血清特異性抗體水平的影響。雞在免疫ND疫苗前3 d，每日給以不同中藥提取物(以總多糖計(jì))，連用 7 d。結(jié)果顯示，桑葉水提物組在首免后的7、14、21、28 d，12 mg 組抗體效價(jià)在大部分時(shí)間點(diǎn)優(yōu)于其他各組；同法給藥，桑葉粗多糖組在首免后的各時(shí)間點(diǎn)，4 mg組抗體效價(jià)優(yōu)于其他各組；杜仲水提物組2 mg組抗體效價(jià)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)優(yōu)于其他各組；杜仲葉水提物組4 mg組抗體效價(jià)在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)優(yōu)于其他各組；杜仲葉多糖組在不同給藥劑量下，12 mg組稍優(yōu)于其他各給藥組，桑葉粗多糖在4 mg給藥劑量下，在首免后7、21、28 d抗體效價(jià)均優(yōu)于其他各組，在首免后14 d抗體效價(jià)與芪黃素對(duì)照組相似。因此，可以初步確定雞每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計(jì))，連用 7 d，可顯著提高血清ND特異性抗體水平。

3.2 桑葉粗多糖對(duì)雞呼吸道和腸道黏膜免疫水平的影響

呼吸道是空氣進(jìn)入機(jī)體的通道，時(shí)刻受到各種微生物及非己物質(zhì)的刺激。呼吸道黏膜免疫系統(tǒng)是呼吸道抵抗外來(lái)病原體入侵的重要防線[18]。呼吸道組織中大量的免疫細(xì)胞均參與介導(dǎo)黏膜固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，合成和分泌大量的分泌型免疫球蛋白(如sIgA)和細(xì)胞因子，在抵抗病原體感染和黏膜疫苗免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[19]。

各組氣管洗液中sIgA濃度隨著時(shí)間的增加逐漸降低。在首免后14～28 d，桑葉粗多糖高、中劑量組氣管洗液中sIgA的濃度均顯著高于免疫對(duì)照和空白對(duì)照，稍優(yōu)于桑葉粗多糖低劑量組和芪黃素對(duì)照組。表明雞以8、4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計(jì))，可有效提高氣管中IgA分泌量，提升呼吸道黏膜免疫水平。

腸道是機(jī)體最大的免疫器官[20]。腸黏膜產(chǎn)生的分泌型IgA(sIgA)，在黏膜表面提供了多種保護(hù)性功能[21]，能減少黏膜表面許多微生物的定居[22]，有效地中和病毒和腸腔中產(chǎn)生的細(xì)菌毒素[23]，并可選擇地轉(zhuǎn)移到其他黏膜組織中，從而為防止病原微生物入侵建立了廣泛而穩(wěn)固的黏膜屏障體系[24-25]。

本試驗(yàn)空腸洗液中sIgA含量的測(cè)定結(jié)果顯示，各組空腸洗液中sIgA濃度也隨著時(shí)間的增加逐漸降低。在免疫初期，桑葉粗多糖各組sIgA含量均顯著高于芪黃素對(duì)照和VC、BC組。表明使用桑葉粗多糖在免疫初期能提高腸道sIgA水平，產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)。在其他大部分時(shí)間點(diǎn)，桑葉粗多糖各組的sIgA含量均顯著高于VC和BC組，稍優(yōu)于芪黃素對(duì)照或與之相似，表明桑葉粗多糖能顯著促進(jìn)小腸sIgA的分泌，從而增強(qiáng)小腸的黏膜免疫功能。

綜上所述，雞每次免疫ND疫苗前3 d，以4 mg/羽給桑葉粗多糖(以總多糖計(jì))，連用7 d，可顯著提高血清ND特異性抗體水平，提高氣管和小腸中sIgA分泌量，增強(qiáng)呼吸道和小腸的黏膜免疫功能。