興化龍香芋脫毒快繁組培技術(shù)體系的建立與優(yōu)化

王 立， 殷劍美， 張培通， 韓曉勇， 郭文琦， 李春宏

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京 210014)

興化龍香芋是江蘇省泰州市興化地區(qū)特有的芋頭品種，其母芋近圓形，肉質(zhì)白、粉而香，子芋少，呈橢圓形，肉質(zhì)粉且糯[1]。興化龍香芋采用垛田種植，生長方式獨(dú)特，種植歷史悠久，耐貯運(yùn)，品質(zhì)優(yōu)良，含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉以及鈣、鐵等礦物質(zhì)，是人們喜食的蔬菜品種之一。隨著紀(jì)錄片《舌尖上的中國》的熱播，興化的垛田龍香芋成功申請了國家地理標(biāo)志保護(hù)，其品牌價值迅速提升，市場需求量巨大。但是，由于生產(chǎn)上常采用塊莖繁殖龍香芋，長期的自繁留種易引起興化龍香芋的種性退化，導(dǎo)致芋病毒病的普遍發(fā)生，從而嚴(yán)重影響興化龍香芋的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]。目前，采用組織培養(yǎng)技術(shù)對芋組織進(jìn)行脫毒快繁的研究已有報道，通過組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)不但可以降低芋植株的發(fā)病率，還能明顯提高芋頭的產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。

正交試驗(yàn)不僅可以大大減少工作量，還可以通過分析極差和方差結(jié)果，發(fā)現(xiàn)組培過程中的關(guān)鍵因素，獲得最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基最優(yōu)組合，因此在植物組織培養(yǎng)中具有重要的應(yīng)用價值[6]。本研究通過對興化龍香芋莖尖組培技術(shù)進(jìn)行研究，旨在建立并優(yōu)化興化龍香芋莖尖脫毒快速繁殖組織培養(yǎng)技術(shù)體系，探索興化龍香芋農(nóng)家優(yōu)良品種脫毒復(fù)壯的有效方法，為優(yōu)良龍香芋種源的生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇大小一致、外表無創(chuàng)傷的興化龍香芋球莖，用0.5% K2MnO4浸泡5 min后，用沙土覆蓋至整個芋塊的2/3處，放置于光照培養(yǎng)箱中，在溫度為25 ℃、相對濕度為70%的條件下催芽10 d左右。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的選取及消毒滅菌 待球莖頂芽生長到3～4 cm 長時，剝除外層2～3層鱗片，切下頂芽，切成帶球莖 1 cm3左右的芽，用流動的水沖洗10 min。在無菌條件下進(jìn)行以下操作：用70%乙醇表面消毒2次，每次30 s，然后放在5%次氯酸鈉溶液中消毒10 min，最后用無菌水清洗3～4次，獲得無菌外植體；使用體視顯微鏡和解剖針將頂芽外層的鱗芽剝除，獲得長1.0 mm左右的莖尖生長點(diǎn)。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 在無菌條件下，對上述所得的無菌外植體進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。培養(yǎng)條件：白天溫度為(25±1) ℃，夜間溫度為(20±1) ℃，濕度為65%～70%，光照度為3 000 lx，光照時間為12 h/d。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基(pH值為5.8)，按照表1的配方分別添加0.1、0.5、1.0 mg/L TDZ(噻苯隆)，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和0.1、0.2、0.3 mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)情況。愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。每個處理設(shè)15個外植體，重復(fù)3次，計算平均值。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)的L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計

1.2.3 不定芽誘導(dǎo) 在無菌條件下，對誘導(dǎo)獲得的愈傷組織進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L 瓊脂為基本培養(yǎng)基，附加0.1、0.5、1.0 mg/L TDZ，0.1、0.5、1.0 mg/L 2，4-D和0.1、0.2、0.3mg/L 6-BA(表1)。培養(yǎng)45 d后，觀察并統(tǒng)計外植體的不定芽誘導(dǎo)情況。不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%。每個處理設(shè)15個愈傷，重復(fù)3次，計算平均值。

1.2.4 不定芽的分化和增殖 將誘導(dǎo)出的不定芽接入以MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，同時附加表1中按L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計的培養(yǎng)基配方，誘導(dǎo)不定芽分化和增殖。培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計不定芽增殖情況。不定芽分化率=(長出不定芽的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%；增殖系數(shù)=增殖后不定芽總數(shù)/接種的不定芽總數(shù)。每個處理設(shè)20個不定芽，重復(fù)3 次，計算平均值。

1.2.5 組培苗生根 將增殖培養(yǎng)所得的1～3 cm高的組培苗切割，接種在以1/2MS+30 g/L蔗糖+6.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，同時附加表2按L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計的培養(yǎng)基配方，誘導(dǎo)不定芽生根，培養(yǎng)30 d后，觀察并統(tǒng)計不定芽的生根情況。生根率=生根外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。每個處理接種10個外植體，重復(fù)3次，計算平均值。

表2 組培苗生根誘導(dǎo)的L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用Excel 2016、SPSS 17.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素水平組合對興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將外植體接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)10～15 d后，開始形成愈傷組織，莖尖開始膨大。由圖1可以看出，30 d左右出現(xiàn)淡黃色團(tuán)狀的愈傷組織；40～55 d左右產(chǎn)生大量疏松的淡黃色顆粒狀愈傷組織；60～70 d后愈傷組織顆粒變成綠色，并開始分化形成不定芽；80～90 d左右可以進(jìn)行不定芽增殖誘導(dǎo)。

表3結(jié)果顯示，隨著TDZ和2，4-D濃度的增加，形成愈傷組織的興化龍香芋外植體數(shù)量不斷增加，愈傷組織誘導(dǎo)率不斷提高。從誘導(dǎo)外植體數(shù)量和愈傷組織誘導(dǎo)率來看，2，4-D的極差均為最大值，表明2，4-D對興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，其次是6-BA、TDZ。結(jié)合表4的方差分析結(jié)果可知，興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素組合是 0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，在此濃度組合下，誘導(dǎo)外植體數(shù)量、愈傷組織誘導(dǎo)率均為最大值，分別為13.67個、91.11%。

2.2 不同激素水平組合對興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)的影響

將不定芽從愈傷組織上切下，轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。由表5不定芽誘導(dǎo)率來看，TDZ的R值最大，其次是2，4-D和6-BA，這表明TDZ對興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)的影響最大。當(dāng)TDZ的激素水平從0.1 mg/L增加到0.5 mg/L時，興化龍香芋的不定芽誘導(dǎo)率極顯著提高(從TDZ濃度為0.1 mg/L時最高的44.44%提高到TDZ濃度為0.5 mg/L時最高的88.89%)；而6-BA對不定芽誘導(dǎo)的增強(qiáng)效果不明顯：當(dāng)TDZ濃度較低(低于0.5 mg/L)時，增加6-BA濃度可以促進(jìn)不定芽分化；而當(dāng)TDZ濃度提高后，增加6-BA濃度反而會抑制不定芽的誘導(dǎo)。方差分析結(jié)果顯示，TDZ的F值最大，與2，4-D、6-BA相比差異極顯著(表6)，表明TDZ的濃度是決定興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)的最重要因素，此結(jié)論與極差分析所得結(jié)論一致。由表5及以上分析可知，興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)的激素最佳組合是0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA，此時不定芽誘導(dǎo)率最高，為 88.89%。

表3 不同水平組合對興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同大寫、小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)、顯著(P<0.05)。表5、表7、表9同。

表4 興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)率的方差分析結(jié)果

注：愈傷組織誘導(dǎo)率的R2=0.976(校正R2=0.902)?！?”表示差異顯著(P<0.05)。

表5 不同水平組合對興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)的影響

表6 興化龍香芋愈傷不定芽誘導(dǎo)的方差分析結(jié)果

注：R誘導(dǎo)率2=0.999(校正R2=0.997)?！?”“**”分別表示差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

2.3 不同激素水平組合對興化龍香芋不定芽分化的影響

由表7中的R值可以看出，3種激素對不定芽分化產(chǎn)生的效應(yīng)大小依次是TDZ>2，4-D>6-BA。由表8的方差分析結(jié)果可知，各水平的TDZ對不定芽分化率和增殖系數(shù)均有顯著影響。綜合分析可以確定，本試驗(yàn)條件下不定芽分化的最佳激素組合為1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA。

表7 不同水平組合對興化龍香芋不定芽分化的影響

表8 興化龍香芋愈傷不定芽誘導(dǎo)方差分析結(jié)果

注：R分化率2=0.986(校正R2=0.944)，R增殖系數(shù)2=0.961(校正R2=0.845)?！?”表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同激素水平組合對興化龍香芋組培苗生根誘導(dǎo)的影響

興化龍香芋組培苗接種在生根培養(yǎng)基內(nèi)10 d左右時，開始長出白色根毛；15～20 d時根毛向四周生長，并形成粗壯根系；30 d左右時生根數(shù)達(dá)到3～5條，根長為2～6 cm；40 d后可以煉苗；經(jīng)過3～5 d的煉苗，將幼苗移栽到營養(yǎng)土基質(zhì)中，30 d后移栽成活率達(dá)到100%。生根過程詳見圖2。

由表9可以看出，NAA、6-BA和活性炭3個因素對不定芽誘導(dǎo)生根的效應(yīng)排序是NAA>活性炭>6-BA。由表9、表10可以看出，NAA對不定芽生根具有顯著影響，其次是6-BA 和活性炭，此結(jié)論與極差分析所得結(jié)論一致。綜合分析可知，興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為 1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L活性炭+30 g/L蔗糖。

表9 不同水平組合對興化龍香芋組培苗生根的影響

表10 興化龍香芋愈傷不定芽誘導(dǎo)方差分析結(jié)果

注：R生根率2=0.984(校正R2=0.937)，R平均生根數(shù)2=0.971(校正R2=0.883)，R平均根長2=0.961(校正R2=0.846)?！?”表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

由于芋類植物長期的無性繁殖，使病毒在其植株中不斷積累、擴(kuò)散，導(dǎo)致病毒病害逐年加重，造成芋頭產(chǎn)量和品質(zhì)下降，出現(xiàn)嚴(yán)重的品種退化[7]。目前，在生產(chǎn)上危害較大的病毒病主要有芋花葉病毒病、黃瓜花葉病毒病、芋桿狀病毒病等[2]。但是，目前在生產(chǎn)中還沒有一種能夠完全免疫病毒病的芋品種，因此，對興化龍香芋開展莖尖脫毒快繁技術(shù)的研究十分必要。通過植物莖尖培養(yǎng)是目前獲得無病毒材料最有效的手段[8]，目前，莖尖培養(yǎng)脫病毒技術(shù)已經(jīng)在以營養(yǎng)繁殖為主的植物中得到了廣泛應(yīng)用，并在馬鈴薯、甘薯、大蒜、香蕉等作物上取得了明顯的增產(chǎn)效果[9-15]。

關(guān)于芋組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)的研究報道很多，但是對于不同的芋品種，相應(yīng)的培養(yǎng)基組分和激素配方存在差異。柏新富等研究了萊陽孤芋的莖尖分生組織離體培養(yǎng)技術(shù)，最終獲得試管苗增殖培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，試管苗生根培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA[16]。詹忠根等對奉化大芋艿的莖尖脫毒苗進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)采用MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率為75%，在培養(yǎng)基中添加芋頭汁、椰子汁等有機(jī)物可以實(shí)現(xiàn)不定芽繼代繁殖和誘導(dǎo)生根一步完成[17]。劉獨(dú)臣等對四川芋品種烏桿槍的莖尖離體培養(yǎng)進(jìn)行研究，得到適宜的莖尖不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L NAA，適宜的生根培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA[18]。韓曉勇等對靖江香沙芋進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，結(jié)果獲得適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L TDZ，最適的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L TDZ，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.02%活性炭[19]。以上結(jié)果說明，對于不同來源和基因型的芋植物組織培養(yǎng)，其增殖分化生根等過程所需要的激素種類和濃度不盡相同，因此對于不同的芋品種開展組織培養(yǎng)，需要對培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進(jìn)行比較和探索，以建立相應(yīng)的組織培養(yǎng)技術(shù)體系。

本研究采用正交設(shè)計方式，研究了激素的種類、濃度及其配比對興化龍香芋組織培養(yǎng)的影響，與傳統(tǒng)單因素試驗(yàn)相比，正交試驗(yàn)?zāi)苋菁{更多的因素和水平，最大限度地減少試驗(yàn)誤差，從而提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率。本研究結(jié)果表明，2，4-D對興化龍香芋愈傷組織誘導(dǎo)的影響最大，適宜的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖；在不定芽誘導(dǎo)和增殖過程中，3種激素對興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)的影響大小依次是TDZ > 2，4-D > 6-BA，不定芽誘導(dǎo)和增殖的適宜培養(yǎng)基分別為MS+0.5 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖和MS+1.0 mg/L TDZ+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA+30.0 g/L蔗糖；適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L活性炭+30.0 g/L蔗糖。