基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記研究進(jìn)展

何虎翼， 樊吳靜， 唐洲萍， 楊 鑫， 李麗淑， 譚冠寧， 何新民

(廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，廣西南寧 530007)

1 植物轉(zhuǎn)座子

植物轉(zhuǎn)座子是廣泛分布于植物基因組中的一類能從染色體的一個(gè)位置跳躍到另一個(gè)位置或者另一條染色體的DNA序列。根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制的不同可分為DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。DNA轉(zhuǎn)座子是一類由DNA介導(dǎo)，通過“剪切-復(fù)制”進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可移動(dòng)元件，包括微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted repeat transposable elements，簡(jiǎn)稱MITEs)和Helitron，其插入位點(diǎn)多態(tài)性豐富、拷貝數(shù)多。MITEs兩端由末端反向重復(fù)序列(terminal inverted repeat，簡(jiǎn)稱TIR)和靶位點(diǎn)重復(fù)序列(target site duplication，簡(jiǎn)稱TSD)組成，富含 T/A，其轉(zhuǎn)座主要依靠自主型DNA轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是一類廣泛分布于植物基因組的由RNA介導(dǎo)，通過“復(fù)制-粘貼”進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可移動(dòng)遺傳因子。根據(jù)是否具有長(zhǎng)末端重復(fù)元件(long terminal repeat，簡(jiǎn)稱LTR)又可分為L(zhǎng)TR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括2種類型——Ty1-copia和Ty3-gypsy，非LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子包括長(zhǎng)散在核重復(fù)序列(long interspersed nuclear element，簡(jiǎn)稱LINE)和短散在核重復(fù)序列(short interspersed nuclear element，簡(jiǎn)稱SINE)。植物轉(zhuǎn)座子具有拷貝數(shù)豐富、插入位點(diǎn)多態(tài)性、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)，非常適合用來開發(fā)分子標(biāo)記。

2 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記類型

目前基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記技術(shù)主要包括序列特異擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-specific amplification polymorphisms，簡(jiǎn)稱S-SAP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-retrotransposon amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱IRAP)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴(kuò)增多態(tài)性(retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism，簡(jiǎn)稱REMAP)、基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入多態(tài)性(retrotransposn-based insertion polymorphisms，簡(jiǎn)稱RBIP)。S-SAP標(biāo)記技術(shù)來源于擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡(jiǎn)稱AFLP)，由限制性內(nèi)切酶Pst1和Mse1消化基因組DNA，通過連接接頭進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，在同一位置片段的有無有判斷其多態(tài)性。不僅可以檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子內(nèi)部變異，還可以用來檢測(cè)插入位點(diǎn)的多態(tài)性[1]。IRAP標(biāo)記技術(shù)是利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增出相鄰?fù)患易宓姆崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子成員間的片段，從而檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)間的多態(tài)性[2]。REMAP標(biāo)記技術(shù)是利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域和微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)的引物，通過PCR擴(kuò)增出反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與相鄰微衛(wèi)星間的片段，從而檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與簡(jiǎn)單重復(fù)序列間的多態(tài)性[2]。RBIP標(biāo)記技術(shù)是以PDR1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)引物，篩選基因組文庫，通過測(cè)序獲得該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子及兩側(cè)翼的堿基序列，再通過設(shè)計(jì)特異引物組合A/E或C/E產(chǎn)生PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[3]。這些基于轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記技術(shù)普遍具有共顯性、高多態(tài)性和高重復(fù)性等特征，已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、變異鑒定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面。

3 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記應(yīng)用

3.1 遺傳多樣性分析

基于PDR1的S-SAP標(biāo)記技術(shù)顯示豌豆屬可分為Pisumfulvum、Pisumabyssinicum、Pisumspp.等3組[4]。基于Tps12、Tps19和PDR1的S-SAP標(biāo)記揭示了55份不同豌豆種間和種內(nèi)的關(guān)系[5]?；赥ms1元件的S-SAP標(biāo)記技術(shù)非常適合用來研究紫花苜蓿的遺傳多樣性[6]?；贐ARE-1、BAGY-1、BAGY-2、Sabrina、Nikita、Sukkula等6個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族的S-SAP分子標(biāo)記可以用來比較大麥的遺傳多樣性[7]。基于Vine-1的S-SAP擴(kuò)增能有效分析葡萄的遺傳多樣性[8]?；赥y1-copia 類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的S-SAP標(biāo)記技術(shù)可用于檢測(cè)不同生態(tài)型黃瓜材料間的多態(tài)性[9]。利用不同酶切組合S-SAP引物建立了適用于糯玉米的DNA圖譜[10]。利用10個(gè)S-SAP引物組對(duì)28份柿屬基因型種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)MseI與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引物組擴(kuò)增性能最優(yōu)[11]?；诜崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的25對(duì)S-SAP引物將28份柿屬植物聚為2組[12]。利用S-SAP標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)短芒大麥突變系種群的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)種群遺傳變異主要存在于種群內(nèi)[13]。利用基于楊梅Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列設(shè)計(jì)的18個(gè)S-SAP引物將48份楊梅試材分為3個(gè)組，分組結(jié)果與地域來源基本一致[14]。

基于2個(gè)不同類copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)將克萊門柚分成北非和西班牙2組，分組結(jié)果與地理來源基本一致[15]。利用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子IRAP標(biāo)記技術(shù)可以將59份烤煙品種分為14個(gè)類群[16]。為分析茄子遺傳多樣性，根據(jù)馬鈴薯和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物并建立了茄子IRAP分子標(biāo)記體系[17]。用基于馬鈴薯和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的2組引物將34份茄子材料分為3大類群[18]。通過優(yōu)化各影響因素，建立了穩(wěn)定的香菇IRAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[19]。與ISSR方法相比，用IRAP標(biāo)記分析煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性的品種間遺傳相異系數(shù)和多態(tài)性比率更高[20]。利用基于小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Wis2-1A的IRAP標(biāo)記技術(shù)可將21個(gè)小麥品種聚成6大類群[21]。沈玉英等利用基于梅Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)體系研究了梅的遺傳多樣性和親緣關(guān)系[22]。杜曉云等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)揭示了部分柿屬種間倍性進(jìn)化關(guān)系[23]?；赥y1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)也適用于檢測(cè)火龍果IRAP多態(tài)性[24]。利用IRAP標(biāo)記可以區(qū)分36份小麥材料的抗性強(qiáng)弱關(guān)系[25]。李慧等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)研究顯示，湖北省建始縣的“關(guān)口葡萄”與歐美雜交雜種親緣關(guān)系最近，其來源可能與“尼加拉”和“白香蕉”有關(guān)[26]。崔博文等利用29條IRAP引物將12份馬尾松種質(zhì)分為3類，并構(gòu)建了DNA指紋圖譜[27]。王燕等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)將48份柿屬植物區(qū)分為野生君遷子居群、柿品種和浙江柿種質(zhì)3組[28]。賈春平等基于4個(gè)稻屬反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用IRAP標(biāo)記方法分析新疆粳稻種質(zhì)資源的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比率為93.4%的Houba/Tos5/Osr13引物最適合于DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，以0.55為閥值將37份新疆粳稻品種(系)分為6大類群[29]。10個(gè)IRAP引物可將49份江西柿屬種質(zhì)資源分為柿、油柿、野柿3種[30]。

沈玉英等利用REMAP標(biāo)記技術(shù)將24個(gè)梅品種聚為3組[31]。通過Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域和ISSR設(shè)計(jì)引物，王東等建立了甜瓜屬REMAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[32]。為鑒定中國水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性，林曉紅等建立了優(yōu)化的REMAP技術(shù)體系[33]。馬忠友等建立了一種基于MITEs的分子標(biāo)記方法，可廣泛應(yīng)用到水稻及其他植物上[34]。利用AhMITE轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)可以鑒定花生栽培種及高世代材料的親緣關(guān)系[35]?；谥参镛D(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳多樣性中的應(yīng)用詳見表1。

表1 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳多樣性中的應(yīng)用

3.2 變異鑒定

利用S-SAP標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)富士蘋果芽變品種產(chǎn)生可能與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入有關(guān)[36]。利用基于蘋果Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子建立S-SAP標(biāo)記技術(shù)可以區(qū)分元帥蘋果芽變[37]。一個(gè)基于蘋果查爾酮合成酶基因啟動(dòng)子的特異性片段可以用來鑒定芽變材料發(fā)生的性狀變異[38]。何平等用7對(duì)基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的S-SAP標(biāo)記引物將15個(gè)蘋果芽變品種區(qū)分為嘎拉系、元帥系和富士系[39]。基于普通歐柑特異片段的S-SAP標(biāo)記技術(shù)可鑒別青甌柑品種[40]。

基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的單引物IRAP-PCR可以有效建立33份柿屬植物基因型的DNA指紋圖譜，可以區(qū)分芽變品種[41]?；诜崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列開發(fā)的分子標(biāo)記可用來鑒定族毛麥染色質(zhì)，提高小麥-族毛麥易位系的利用價(jià)值[42]?；谔O果反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物的IRAP標(biāo)記技術(shù)可以鑒定部分芽變品種[43]。通過利用IRAP引物鑒定元帥蘋果和富士蘋果無性系芽變，揭示轉(zhuǎn)座插入和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間重組是蘋果無性系變異的重要機(jī)制[44]。利用IRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建的蘋果指紋圖譜，可以作為短枝和著色芽變鑒定的依據(jù)[45]?；诜崔D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子引物IRAP標(biāo)記可鑒定遺傳背景高度相似的磨盤柿芽變[46]。林曉紅等利用IRAP標(biāo)記技術(shù)研究中國水仙自然變異體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子插入和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子間重組是中國水仙變異的重要機(jī)制[47]。IRAP引物標(biāo)記可用于分析金棗柿實(shí)生后代的遺傳變異[48]。利用基于旱酥梨及其紅皮芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)可以建立DNA指紋圖譜[49]。

成文革等用REMAP標(biāo)記技術(shù)分析吉生羊草體細(xì)胞無性系變異，發(fā)現(xiàn)其遺傳相似性系數(shù)范圍比ISSR技術(shù)要大[50]。馮榮芳等用基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的REMAP標(biāo)記技術(shù)證實(shí)紅翎菜科海藻存在較高程度變異[51]?；贏hMITE1轉(zhuǎn)座子標(biāo)記技術(shù)可以有效鑒定花生F1代雜種的真實(shí)性[52]。利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子標(biāo)記可對(duì)栽培種花生F1代雜交種子的真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定[53]。基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在變異鑒定中的應(yīng)用詳見表2。

表2 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在變異鑒定中的應(yīng)用

3.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

基于Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物可以分析棉屬不同種，構(gòu)建棉花高密度遺傳圖譜[54]。王利英等根據(jù)大麥和煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Bare-1、Tto1的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)引物，建立了茄子IRAP和REMAP分子標(biāo)記技術(shù)體系[55]。用基于煙草反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tnt1的LTR區(qū)域設(shè)計(jì)的引物可將32個(gè)百合品種完全區(qū)分[56]。李芳等利用基于蘿卜Ty1-copia 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的IRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了14個(gè)蘿卜品種指紋圖譜[57]。在基于MITEs結(jié)構(gòu)特征開發(fā)的119條引物中，21個(gè)MITEs位點(diǎn)間多態(tài)性(inter-MITE polymorphism，簡(jiǎn)稱IMP)標(biāo)記可以整合定位到1個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜上[58]?；谥参镛D(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用詳見表3。

表3 基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用

4 結(jié)論

植物轉(zhuǎn)座子是廣泛分布于植物基因組中的一類可移動(dòng)元件，可分為DNA轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。植物轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)豐富、插入位點(diǎn)多態(tài)性、高度異質(zhì)性等特點(diǎn)，非常適合用來開發(fā)分子標(biāo)記。本研究在了解國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，分析基于植物轉(zhuǎn)座子的S-SAP、IRAP、REMAP、RBIP等分子標(biāo)記差異，歸納了這些標(biāo)記在遺傳多樣性分析、變異鑒定以及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的應(yīng)用。隨著越來越多植物全基因組序列的發(fā)布，在全基因組水平上鑒定植物轉(zhuǎn)座子、高通量開發(fā)基于植物轉(zhuǎn)座子的分子標(biāo)記將成為可能。