多囊卵巢綜合征并胰島素抵抗大鼠高分子脂聯(lián)素表達及二甲雙胍的影響

張莉 高旭峰 王玉環(huán)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種生殖異常和糖代謝紊亂并存的婦科內(nèi)分泌性疾病，個體表現(xiàn)差異大，主要以高雄激素和/或胰島素抵抗為主要特點[1-3]。高分子量脂聯(lián)素(high-molecular weight Adiponectin,HMW APN)是脂聯(lián)素多聚體中最具生物活性的形式，具有調(diào)節(jié)糖、脂代謝，增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[4]。不少研究發(fā)現(xiàn)HMW APN與胰島素抵抗關(guān)系密切。二甲雙胍既可以降低血糖，改善胰島素敏感性，又可以調(diào)節(jié)血脂，對PCOS患者臨床癥狀有一定作用。本實驗觀察PCOS大鼠血清HMW APN水平及二甲雙胍對HMW APN、性激素的調(diào)節(jié)作用及脂聯(lián)素基因的影響，分析PCOS大鼠體內(nèi)血清HMW APN水平變化及其與生理生化指標的關(guān)系，或可為PCOS的發(fā)病機制研究提供新思路，為治療提供新的藥物靶點。

材料與方法

1.材料

(1) 動物：選用健康4周齡雌性SD(Sprague Dawley)大鼠共40只，清潔級，體重80～120 g(購買于西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心)。

(2) 試劑及儀器設(shè)備：包括來曲唑(美國Selleck公司)，二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司),胰島素、高分子脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫試劑盒(上海嵐派生物科技有限公司)，酶標儀，恒溫孵育箱，移液槍、真空采血管(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，性激素放免試劑盒(天津德普公司)等。

2.方法

(1) 動物模型建立及分組：40只4周齡雌性SD大鼠，體重(100±20)g,耳標標記，使用隨機數(shù)字表平均分成4組：正常組(normal control，NC)、PCOS組、胰島素抵抗組(insulin resistance，IR)、PCOS-IR組。每組2籠，每籠 5 只。所有大鼠在第0周適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，動物室內(nèi)設(shè)置晝夜12 h 循環(huán)，自由飲水及攝食。從第1周開始進行造模，將之前設(shè)定為IR組和PCOS-IR組的大鼠給予60%高脂飼料喂養(yǎng)，其余2組給予普通飼料，高脂喂養(yǎng)至實驗結(jié)束。PCOS造模期間每天4組大鼠在10:00、15:00分別做陰道涂片，連續(xù)監(jiān)測14 d，直至明確獲得每只大鼠的一個完整性周期，40只大鼠均存在正常動情周期(圖1)，進入后續(xù)PCOS造模。第3周開始，之前設(shè)定為PCOS組和PCOS-IR組的大鼠給予灌服1 mg/kg的來曲唑溶解于1%羧甲基纖維素溶液,連續(xù)21 d[5-6]，NC組及IR組給予等體積1%羧甲基纖維素溶液。每日陰道液涂片并顯微鏡觀察、記錄涂片中細胞類型及判斷所處發(fā)情周期，若PCOS及PCOS-IR組大鼠完全失去周期性變化(即持續(xù)處于間情期)，提示PCOS造模成功(第5周)。第5周末4組大鼠取尾靜脈抽血測空腹血糖及空腹胰島素，計算HOMA-IR結(jié)果提示(表1)：IR組、PCOS組、PCOS-IR組的HOMA-IR 均高于NC組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示5周高脂飲食誘導(dǎo)SD大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗，大鼠各組模型成功建立。造模過程中PCOS及PCOS-IR組大鼠各原因不明死亡2只，故造模成功后PCOS組為8只、PCOS-IR組為8只。

圖1 大鼠正常動情周期

組別n空腹血糖 (mmol/L)空腹胰島素 (mU/L)HOMA-IRNC組 104.13±0.8814.50±0.422.64±0.30IR組105.62±1.29*15.19±1.004.24±0.45*PCOS組85.07±0.9017.37±0.473.85±0.75*PCOS-IR組 86.06±0.45**21.90±0.745.72±0.37**

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001

(2) 實驗方法：從第6周起，二甲雙胍干預(yù)4周：PCOS-IR組給予二甲雙胍(0.5 mg/g)，NC組、IR組、PCOS組均給予等體積的生理鹽水。末次給藥后，禁食禁水12 h后，行 OGTT 試驗，以 50%葡萄糖溶液按 2 g/kg 灌胃，測 0 min、 30 min、 60 min 和 120 min 血糖，并留血清測OGTT胰島素水平。計算 AUC；后用10%水合氯醛，0.30 ml/100g腹腔注射進行麻醉，經(jīng)腹主動脈取血到無抗凝劑的離心管中，4℃靜置20 min，離心，取血清，用于性激素等指標測定；分離取雙側(cè)卵巢，一側(cè)用10%福爾馬林溶液固定，留用于石蠟包埋切片，HE染色，另一側(cè)置 1.5 ml 無酶EP管中，-80℃冰箱保存，用于Real-Time PCR檢測。

(3) 大鼠陰道涂片方法:取待檢查的雌鼠置于操作臺上(避免未檢查大鼠受其影響)，安撫并清理毛上的墊料，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指輕壓其后腰背部，翻起尾巴露出陰道口，清理糞便后，用棉簽蘸取少量生理鹽水在大鼠陰道涂抹數(shù)次，涂片，吉姆薩染液染色并采集圖片。

3.生化指標測定：血糖由羅氏血糖儀測定；穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù) (homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)[7]：HOMA-IR=空腹胰島素×FBG/22.5；OGTT血糖曲線下面積(AUC)：曲線下面積=1/2×(0小時血糖值+0.5小時血糖值)×0.5+1/2×(2小時血糖值+0.5小時血糖值)×1.5=0.25×(0小時血糖值+4×0.5小時血糖值+3×2小時血糖值)。陰道涂片用吉姆薩染色觀察動情周期；放射免疫法檢測促卵泡生成素、促黃體生成素、睪酮(上海嵐派生物科技有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測HMW APN、胰島素水平(上海嵐派生物科技有限公司)。

4.卵巢組織形態(tài)學觀察：HE染色，200及400倍光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學變化；RT-PCR檢測并分析卵巢組織中Adiponectin、 AdipoR1和AdipoR2表達水平。

結(jié)果

1.實驗中各組大鼠的空腹血糖及OGTT血糖變化

各組大鼠FBG(0周)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模成功時(第5周)，IR組、PCOS-IR組大鼠FBG分別與各自組0周FBG相比均增加(P<0.05)，PCOS組FBG較NC組FBG增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，IR組、PCOS-IR組大鼠FBG較NC組FBG增加，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第6周末，IR組與同齡NC組大鼠相比較，F(xiàn)BG增加(P<0.001)，兩組差異直到第12周末灌胃結(jié)束仍存在，PCOS-IR組大鼠與同齡NC組大鼠相比FBG無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，直至灌胃結(jié)束；PCOS-IR組大鼠與同齡IR組、PCOS組大鼠相比，F(xiàn)BG降低有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，直至灌胃結(jié)束。見表2。

表2 實驗中各組大鼠空腹血糖情況

注:與0周比較,△P<0.05; 與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較，▲P<0.05

二甲雙胍干預(yù)后，與IR組，PCOS組相比，PCOS-IR組曲線下面積AUC減低(P<0.05)。與NC組大鼠相比，IR組、PCOS組曲線下面積均增加，但僅IR組曲線下面積增加有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即出現(xiàn)了一定程度的糖耐量降低。見表3。

表3 實驗中各組大鼠OGTT血糖情況

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較,▲P<0.05

2.實驗中各組大鼠的性激素改變

二甲雙胍干預(yù)后，與NC組相比，PCOS組、PCOS-IR組血清睪酮水平增加差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與IR組相比，PCOS組、PCOS-IR組黃體生成素增加(P<0.05)。PCOS組、IR組大鼠血清高分子脂聯(lián)素水平均較NC組降低且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯(lián)素水平較NC組減低，但差異不明顯；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯(lián)素水平較IR組及PCOS組增高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 實驗中各組大鼠激素情況

注:與NC組比較,*P<0.05,**P<0.001; 與IR組比較,#P<0.05,##P<0.001; 與PCOS組比較,▲P<0.05，▲▲P<0.001

3.各組大鼠卵巢大體及HE染色形態(tài)

PCOS組、PCOS-IR組大鼠卵巢體積大，可見較多囊狀卵泡。

卵巢病理學改變：NC組、IR組可見不同發(fā)育階段的卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細胞呈現(xiàn)多層，多為8～9層(圖2-5 A、D)，PCOS組、PCOS-IR組可見囊性擴張的卵泡，黃體及各發(fā)育階段的卵泡相對較少，顆粒細胞成數(shù)少。見圖2。

4.高分子脂聯(lián)素及其受體基因表達情況

IR組、PCOS組較NC組Adiponectin基因表達均增加，但無統(tǒng)計學意義；PCOS-IR組較IR組、PCOS組Adiponectin基因表達有所降低(P<0.05)，PCOS-IR組卵巢AdipoR2基因的表達較PCOS組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠卵巢組織Adiponectin及其受體mRNA表達水平

注:與IR組比較,#P<0.05; 與PCOS 組比較,▲P<0.05

5.各組大鼠血清高分子脂聯(lián)素與空腹血糖、空腹胰島素、性激素相關(guān)性分析

血清高分子脂聯(lián)素與空腹胰島素、HOMA-IR、睪酮呈正相關(guān)(r值分別為0.739、0.676、0.703，P<0.05)。

討論

多囊卵巢綜合征是育齡婦女不孕的重要原因之一，常見的表現(xiàn)有多毛、肥胖、月經(jīng)紊亂、不孕，多伴發(fā)一些代謝紊亂和遠期并發(fā)癥，如高胰島素血癥、糖尿病、血壓升高、血脂譜異常、心血管疾病，甚至癌癥[8-9]。關(guān)于建立PCOS動物模型方法很多，有脫氫表雄酮誘導(dǎo)法、雄激素誘導(dǎo)法、孕激素聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素誘導(dǎo)法及來曲唑誘導(dǎo)法等。這些仿動物內(nèi)分泌及組織學方面的變化與臨床較接近[10]，符合PCOS動物的造模要求。不同方法在誘導(dǎo)PCOS動物模型時，卵巢變化及性激素改變存在差異。本研究為除外外用性激素對結(jié)果的影響，采用來曲唑誘導(dǎo)PCOS大鼠模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS組和PCOS-IR組大鼠無明顯的動情周期，即呈無排卵狀態(tài)；血清睪酮、黃體生成素水平分泌增加，呈高雄激素、高黃體生成素狀態(tài)，卵巢多囊樣變；兩組均出現(xiàn)的糖耐量異常，空腹胰島素、HOMA-IR均高于NC組。以上改變說明大鼠存在胰島素抵抗及生殖功能障礙，可以作為PCOS研究模型。

PCOS患者大多通過藥物治療，同時結(jié)合控制飲食、運動減輕體重的方法，很少進行手術(shù)治療，故臨床取材相對困難。IR在POCS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，故臨床上常應(yīng)用改善IR的藥物，通過改善PCOS患者的糖脂代謝紊亂，進而改善患者體內(nèi)激素水平達到治療的效果，增加排卵率。本研究應(yīng)用二甲雙胍后PCOS-IR大鼠糖耐量異常和卵巢狀態(tài)均有所改善(P<0.05)。但大鼠HOMA-IR改善不明顯，可能與用藥時間相對較短有關(guān)。二甲雙胍并非專治PCOS的藥物，只是針對存在胰島素抵抗及糖脂代謝異常的PCOS患者可能發(fā)揮一些作用，并非對所有患者都有效。因此，進一步探索PCOS的更詳細發(fā)病機制，找到治療PCOS患者安全、有效的藥物仍存在很大的挑戰(zhàn)。

高分子脂聯(lián)素是脂聯(lián)素多聚體中最具生物活性的一種形式[11]，具有調(diào)節(jié)糖、脂代謝、增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化等作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，相較總脂聯(lián)素，HMW-APN與IR[3]、代謝綜合征、PCOS[12]的關(guān)系更密切，HMW APN或可作為PCOS防治的潛在物質(zhì)，為PCOS的病理生理機制研究提供新思路，為治療提供新的藥物靶點。一項針對PCOS青年患者研究發(fā)現(xiàn)[3]，體內(nèi)存在胰島素抵抗的PCOS患者血清HMW APN明顯減少，且HMW APN與胰島素抵抗呈負相關(guān)。血清HMW APN水平降低可能是PCOS患者體內(nèi)胰島素抵抗和代謝異常的一個決定因素。Wickham等[13]將PCOS患者分為正常雄激素組和高雄激素組進行對比發(fā)現(xiàn)，相較正常雄激素組，高雄激素組患者血清 HMW-APN 明顯減少，胰島素抵抗也明顯增加。故在PCOS患者體內(nèi)HMW APN與IR呈負相關(guān)，與胰島素敏感性呈正相關(guān)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)PCOS組、IR組大鼠血清高分子脂聯(lián)素水平均較NC組降低(P<0.001)；PCOS-IR組大鼠血清高分子脂聯(lián)素水平較PCOS組增加(P<0.001)；同時PCOS-IR組高分子脂聯(lián)素基因表達較IR組、PCOS組降低(P<0.05)；IR組、PCOS組高分子脂聯(lián)素基因表達較NC組增加，但差異不明顯，可能是由于IR組、PCOS組大鼠糖代謝、性激素紊亂導(dǎo)致血清高分子脂聯(lián)素分泌減少，機體代償性使其基因表達增加。也可能由于二甲雙胍用藥時間相對較短，這種差異未完全表現(xiàn)出，說明二甲雙胍可以通過影響PCOS-IR大鼠的高分子脂聯(lián)素基因表達，改善胰島素抵抗的同時改善PCOS的癥狀。

綜上，血清高分子脂聯(lián)素在胰島素抵抗大鼠、PCOS大鼠中表達均減少。二甲雙胍可以調(diào)節(jié)糖代謝水平，減輕PCOS大鼠卵巢多囊性改變，增加HMW APN水平，從而達到改善PCOS的目的。下一步需要對二甲雙胍是通過何種機制影響高分子脂聯(lián)素水平來達到改善PCOS的目的進行深入研究。

(圖2見封底)