細(xì)菌RpoN蛋白的研究進展

王冬雪，夏 明，孟慶峰,2，單曉楓

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 長春 130118；2.吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，長春 13000）

RpoN是σ家族的唯一成員，最早在肺炎克雷伯氏菌中克隆得到，隨后在固氮菌、根瘤菌、紅細(xì)菌以及假單胞菌中也克隆到了類似序列，起初的研究認(rèn)為RpoN僅僅與氮代謝相關(guān)，但后續(xù)的研究表明其還與逆迫應(yīng)答、碳源的利用、運動及毒力等基因表達(dá)相關(guān)。近年來有關(guān)RpoN的研究報道逐年增多，它能夠調(diào)控多個功能基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，在很多細(xì)菌中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

1 σ因子簡介

轉(zhuǎn)錄是生物合成的必要步驟，由多種蛋白共同作用，RNA聚合酶是該過程的重要蛋白，聚合酶全酶包括核心酶（α2ββ'）和σ因子兩大部分，大多數(shù)σ因子是一類相對較小的蛋白家族，它們通過可逆地與聚合酶的核心酶結(jié)合并參與識別啟動子。在轉(zhuǎn)錄的過程中，σ因子作為一種多肽不與DNA結(jié)合，RNA聚合酶全酶與啟動子結(jié)合時可產(chǎn)生較牢固的復(fù)合物，在解旋的位置又可轉(zhuǎn)變?yōu)檩^疏松的復(fù)合物。當(dāng)全酶與σ因子分開后，核心酶沿著DNA鏈移動進行延伸，以此進行轉(zhuǎn)錄。原核生物可通過σ因子選擇性的與啟動子結(jié)合從而進行自身調(diào)節(jié)。根據(jù)序列的相似程度以及功能的差異，可將σ家族分為σ70（RpoD、RpoS、RpoH等）和σ54（RpoN）家族，σ70在一般細(xì)菌中主要負(fù)責(zé)管家基因的調(diào)控；σ54（RpoN）控制一套多元化基因的轉(zhuǎn)錄，能調(diào)控很多不同基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。且不同σ因子之間存在相互作用。

RpoN是σ54家族中唯一的成員，在不同細(xì)菌中具有相似性?；谛蛄邢嗨菩缘奶攸c可將其分為3個區(qū)域：區(qū)域1由25～50個氨基酸構(gòu)成α2螺旋，富含Leu和Gln；區(qū)域2為可變區(qū)域，包含60～110個氨基酸序列，多數(shù)為酸性氨基酸殘基；區(qū)域3是序列的羧基端，大約含有400個殘基，這個區(qū)域又包含X-LINK構(gòu)象、HTH構(gòu)象和完全保守區(qū)的RpoNBOX（含有10個保守的氨基酸殘基）[1]三種典型的構(gòu)象。

2 RpoN的發(fā)現(xiàn)及功能初探

對于RpoN的研究最早見于1985年，Merrick和Gibbins在肺炎克雷伯氏菌中克隆到RpoN基因。隨后，在固氮菌、根瘤菌、紅細(xì)菌以及假單胞菌中也克隆到了類似序列。起初的研究認(rèn)為RpoN僅僅與氮代謝相關(guān)，但后續(xù)的研究表明RpoN可調(diào)控多種生物學(xué)特性。

2.1 RpoN在氮源調(diào)控的研究 自RpoN被研究以來，RpoN在氮代謝的功能最早被發(fā)現(xiàn)。一般來說，細(xì)菌中的氮循環(huán)都需要經(jīng)過氨氧化、同化以及硝化的過程，當(dāng)形成NH4+才能參與細(xì)菌的生命活動，供菌體利用。研究報道，RpoN蛋白基因的缺失會導(dǎo)致細(xì)菌對氮源利用能力的減弱甚至喪失。大腸桿菌中RpoN蛋白基因敲除的缺失株與野生株相比較，NH4Cl利用能力明顯下降；而丁香假單胞菌、綠膿桿菌RpoN缺失株則無法利用氮源生長[2]。

2.2 RpoN在碳源調(diào)控的研究 對RpoN的研究最初見于細(xì)菌氮源同化上，但隨著深入研究發(fā)現(xiàn)它在碳源調(diào)控中也扮演重要角色。在惡臭假單胞菌中，由于其生活條件較為復(fù)雜，有多種可被利用的碳源，當(dāng)RpoN被缺失，其雖然可以在以苯乙烯為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長，卻不能在以苯乙酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，而野生菌株卻可以在兩種碳源中均可生長，通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯通透性酶編碼基因paal無法在RpoN基因缺失株中表達(dá)，產(chǎn)生所謂的碳代謝抑制現(xiàn)象。除了直接調(diào)控某些碳代謝途徑的關(guān)鍵酶外，RpoN還通過調(diào)控非編碼RNA參與多種碳源的利用過程：丁香假單胞菌中存在CrcX參與碳調(diào)控過程；在綠膿桿菌中，還存在一個雙組分系統(tǒng)CbrAB與RpoN共同調(diào)控CrcZ、CrcY基因表達(dá)量從而影響碳代謝過程，綠膿桿菌RpoN缺失株中CrcZ和CrcY表達(dá)量下降[3]，進一步研究發(fā)現(xiàn)在RpoN缺失株中仍能檢測到CrcZ、CrcY基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，只是這兩個基因的轉(zhuǎn)錄受到RpoN的影響。

2.3 調(diào)節(jié)細(xì)菌運動能力

2.3.1 參與細(xì)菌的鞭毛合成過程 運動是細(xì)菌趨化以及定殖的關(guān)鍵，細(xì)菌的重要運動器官是鞭毛，不同菌株的鞭毛合成過程類似，但其調(diào)控機制卻存在很大差別。研究表明RpoN與細(xì)菌鞭毛的形成以及調(diào)控細(xì)菌的定殖存在一定關(guān)聯(lián)。據(jù)報道，在綠膿桿菌中，RpoN蛋白基因缺失導(dǎo)致其對上皮細(xì)胞的粘附力下降，通過電鏡觀察菌體完全喪失鞭毛結(jié)構(gòu)；在遲鈍愛德華氏菌中，RpoN的缺失也顯著影響細(xì)菌的運動能力；在研究大腸桿菌改為RpoN蛋白基因其與鞭毛的合成相關(guān)，控制著菌體的運動性，但并未發(fā)現(xiàn)RpoN蛋白基因識別保守結(jié)合位點，推測RpoN蛋白基因通過FlhDC間接調(diào)控鞭毛調(diào)節(jié)因子fliA的表達(dá)，或者RpoN蛋白基因與FliA共同調(diào)控鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；通過透射電鏡觀察斯氏假單胞菌A1501RpoN蛋白基因缺失株發(fā)現(xiàn)缺失株無鞭毛，又通過趨化試驗觀察到該菌株喪失運動能力；由芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌RpoN蛋白基因缺失株中50個鞭毛基因中有43個基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。由此可見，RpoN蛋白基因在鞭毛基因的表達(dá)調(diào)控中扮演重要角色。

2.3.2 參與菌毛合成過程 細(xì)菌的菌毛分為P菌毛、I型菌毛和IV菌毛等，它與細(xì)菌的黏附、運動以及致病性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌菌毛合成受到RpoN的調(diào)控，同時RpoN的缺失導(dǎo)致其菌體黏附能力顯著下降[3]；在長奈瑟球菌以及假單胞菌RpoN缺失株中菌毛的合成及運動也會顯著下降[4]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，很多革蘭氏陰性菌RpoN對菌毛合成過程的影響主要源于PilA的調(diào)控，PilA受RpoN和PilR-pilS共同調(diào)控，PilS接受外界信號刺激后自身發(fā)生磷酸化，隨后磷酸化PilR，磷酸化的PilR與RpoN共同激活PilA轉(zhuǎn)錄起始[5]，通過翻譯、組裝、形成菌毛的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。

2.4 調(diào)控生物被膜合成及毒力相關(guān) 細(xì)菌的胞外多糖被認(rèn)為與該細(xì)菌毒力、生物被膜合成能力及耐藥性有很大關(guān)系。相關(guān)研究表明，在遲鈍愛德華菌中RpoN缺失能導(dǎo)致生物被膜形成能力下降；在固氮施氏假單胞菌中RpoN蛋白基因的缺失卻導(dǎo)致生物被膜形成能力喪失；但在鼠傷寒沙門氏菌中，RpoN蛋白基因缺失株卻導(dǎo)致生物被膜形成能力增強，使細(xì)菌在不利條件下產(chǎn)生胞外聚合物黏附在介質(zhì)表面，以固著的方式形成生物被膜，以便適應(yīng)不利環(huán)境。所以說RpoN是重要的壓力調(diào)控因子，這一發(fā)現(xiàn)為進一步研究RpoN調(diào)控生物被膜形成機制奠定了基礎(chǔ)。細(xì)菌生物被膜存在于非生物或生物表面，一直被認(rèn)為與病原菌毒力密切相關(guān)，其存在可以為病原菌抵抗不同的環(huán)境壓力、避免免疫系統(tǒng)清除以及來自宿主的各種化學(xué)防御[6-7]，因此對于細(xì)菌被膜的研究從某種意義上就是對其毒力的研究。

3 RpoN蛋白表達(dá)調(diào)控的研究

3.1 RpoN蛋白調(diào)控其他σ因子表達(dá) 在革蘭氏陽性菌中，σ因子之間相互的級聯(lián)調(diào)控關(guān)系控制著連續(xù)的基因表達(dá)；而在革蘭氏陰性菌中，σ因子控制著離散基因簇的表達(dá)[8]。σ因子之間的相互作用使得不同的壓力信號得以整合從而產(chǎn)生相互協(xié)調(diào)的基因應(yīng)答。有試驗證實RpoN與RpoS之間存在拮抗作用，雙缺失后在許多菌體中產(chǎn)生了相反的效應(yīng)：遲鈍愛德華氏菌中基因芯片結(jié)果顯示RpoN調(diào)節(jié)子中60%受RpoS調(diào)控，RpoN的缺失對RpoS的表達(dá)具有正調(diào)控；σ70家族蛋白FliA受RpoN的正調(diào)控；在大腸桿菌中σ因子之間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系涉及到菌體運動性、氮源利用、壓力調(diào)控以及其他細(xì)胞功能[9]。試驗發(fā)現(xiàn)σ因子的相互作用是依賴于σ因子之間的相對含量以及它們對RNA聚合酶核心酶的親和力。除此之外，相關(guān)研究表明，在鼠傷寒沙門氏菌中RpoN、RpoE、RpoH、RpoS、RpoD等σ因子在指數(shù)期和生物被膜形成期的基因表達(dá)有差異[10]。

3.2 控制RpoN蛋白基因轉(zhuǎn)錄的因子 RpoN作為一個σ因子，是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要組分，控制其轉(zhuǎn)錄的因子主要有以下幾種。

3.2.1 c-di-GMP c-di-GMP是細(xì)菌體內(nèi)普遍存在的第二信使分子，它能夠激活級聯(lián)系統(tǒng)中蛋白的活性，它可以瞬間升高、且能快速降低，并由此調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝系統(tǒng)的酶活性，控制細(xì)胞的生命活動，包括：葡萄糖的攝取和利用、脂肪的儲存和移動以及細(xì)胞產(chǎn)物的分泌。第二信使也控制著細(xì)胞的增殖、分化和生存，并參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明，高濃度c-di-GMP調(diào)節(jié)生物膜的形成，低濃度c-di-GMP抑制生物膜的形成。c-di-GMP控制生物膜胞外多糖編碼的產(chǎn)生，通過Bcam1330-Bcam1341基因推動細(xì)菌蛋白的提升。GMP與增強子結(jié)合調(diào)節(jié)生物膜胞外多糖的穩(wěn)定并激活RpoN依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。c-di-GMP 作用的核開關(guān)是目前唯一發(fā)現(xiàn)的不參與代謝活動而參與信號傳導(dǎo)的核開關(guān),其發(fā)現(xiàn)有利于解釋c-di-GMP生物學(xué)功能的多樣性。洋蔥伯克霍爾德氏菌中RpoN蛋白基因的缺失株無生物膜合成能力，通過激活編碼c-di-GMP后發(fā)現(xiàn)胞外多糖合成基因可在其中進行表達(dá)，因此推測c-di-GMP是RpoN的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[11]，但是對c-di-GMP的確切調(diào)控機制目前仍不十分清楚，還有待更深入的研究。

3.2.2 RpoN的啟動子對轉(zhuǎn)錄的影響 啟動子為轉(zhuǎn)錄的起始位點上游鄰近的功能區(qū)。RpoN啟動子的保守區(qū)分布在起始位點上游的-12和-24位置。很多細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄都依賴于RpoN啟動子，從而控制許多生物學(xué)特性，如趨化性或運動性[12]。在大腸桿菌中，有接近100個RpoN分子，但真正為RpoN依賴型啟動子的數(shù)量卻不到20個；在鐵還原菌中，受到RpoN負(fù)調(diào)控的基因（如fliL、fdnG、nifEN）啟動子區(qū)結(jié)合位點相對受正調(diào)控的基因（glnB、dcuB）的位點更加保守，這些序列上的差異可能導(dǎo)致RpoN對不同基因的調(diào)控差異；還有研究將非典型RpoN依賴型啟動子中人為引入保守結(jié)合元件，可導(dǎo)致RpoN與啟動子結(jié)合能力增強，同時-12區(qū)的GC含量變化也會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的能力的喪失。RpoN啟動子參與調(diào)控多種代謝過程，包括甲苯和二甲苯的降解、二羧酸的輸送、菌毛蛋白的合成、氮固定、氫攝取、鞭毛組裝、精氨酸分解、藻蛋白酸鹽生成、鼠李糖脂生成、乙偶姻分解苷露糖攝取和脯氨酸亞氨基肽酶激活[13]。因此，啟動子對于RpoN的轉(zhuǎn)錄存在至關(guān)重要的影響。

3.2.3 EBPs RpoN的轉(zhuǎn)錄需要某些特定激活蛋白（enhance binding proteins）的參與，他們通過改變轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物構(gòu)象來與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物發(fā)生作用。激活蛋白結(jié)合在UAS區(qū)，并在宿主因子幫助下在UAS區(qū)與啟動子之間插入一個回折。激活蛋白上σ54-RNAP核心酶結(jié)構(gòu)域具有能水解ATP的腺苷酸三磷酸酶的活性[14]。增強蛋白屬于雙組分調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)菌處于低濃度氮源時，組氨酸激活酶NtrB促使NtrC磷酸化，從而結(jié)合到UAS區(qū)激活轉(zhuǎn)錄；高濃度氮源時，磷酸化的NtrC減少，非磷酸化的NtrC雖然會結(jié)合到UAS區(qū)，卻無法激活轉(zhuǎn)錄的功能。在致病性鉤端螺旋體中，通過對RpoN的激活蛋白FhlA的研究中發(fā)現(xiàn)，fhlA缺失株中確定LA1188、LA1968、AmtB表達(dá)量均下調(diào)，推測其通過FhlA-RpoN信號通路從而影響轉(zhuǎn)錄。所以，激活蛋白對RpoN的轉(zhuǎn)錄是必不可少的。

4 展望

目前，在很多菌種中對RpoN都有一定的的研究。RpoN蛋白基因缺失細(xì)菌在一些不同的環(huán)境壓力下存活能力減弱，如酸堿性環(huán)境、高滲環(huán)境、饑餓條件、氧化耐受條件下存活能力改變，表明RpoN是重要的壓力調(diào)控因子同時還調(diào)控氮源以及碳源的利用，對鞭毛以及生物被膜的合成也存在一定影響，細(xì)菌對于基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控并不是簡單的單一通路，細(xì)菌必須通過各種信號通路確?；虻谋磉_(dá)，以適應(yīng)不同的環(huán)境，其中RpoN就是典型的調(diào)控基因，RpoN作為一個σ因子，是細(xì)菌轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一個重要組分，RpoN轉(zhuǎn)錄組水平的研究，對于調(diào)控細(xì)菌的研究機制來說，具有積極意義。

近年來由于環(huán)境的破壞以及抗生素的濫用，使得在養(yǎng)殖業(yè)中對細(xì)菌病防治越來越難。RpoN調(diào)控多種基因，由于RpoN的缺失也能導(dǎo)致細(xì)菌的致病能力的下降，因此RpoN的研究為細(xì)菌防治提供新的策略。σ家族調(diào)控的基因數(shù)量是非常大的，其次不同家族成員的多缺失情況下也會產(chǎn)生不同的結(jié)果。σ因子之間存在復(fù)雜的相互聯(lián)系，其相互作用機制還有待我們深入研究。

另外，維氏氣單胞菌廣泛分布于自然環(huán)境中，動物感染后癥狀多為急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎、心內(nèi)膜炎等，近年來，維氏氣單胞菌毒力逐漸增強，因此越來越多的研究人員開始對其產(chǎn)生興趣。RpoN在很多菌屬中是一系列毒力、壓力、運動相關(guān)的重要調(diào)控者。本實驗室一直致力于維氏氣單胞菌的研究，實驗團隊積極構(gòu)建該基因的缺失株及互補株，為維氏氣單胞菌RpoN功能研究奠定基礎(chǔ)，同時，也為豐富不同菌株RpoN性質(zhì)提供數(shù)據(jù)的支持。