細(xì)胞焦亡與臨床疾病及其相關(guān)信號通路①

伊宏煜 王 濤 谷孫澤棟 陳麗華 連建奇

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，西安710000)

2001年Brennan等[1]首次發(fā)現(xiàn)了一種由caspase1介導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡現(xiàn)象，并將其定義為“細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)”，從而把這種具有促炎和細(xì)胞溶解性質(zhì)的新型細(xì)胞程序性死亡途徑同細(xì)胞凋亡、壞死區(qū)分開來。

通常意義上來說，細(xì)胞焦亡是機(jī)體對于感染的一種免疫防御機(jī)制。然而，過度的細(xì)胞焦亡所引起的異常炎性反應(yīng)和免疫細(xì)胞的大量死亡可能會導(dǎo)致宿主免疫功能的嚴(yán)重?fù)p害甚至有發(fā)生自身免疫性疾病和敗血癥的可能。所以對細(xì)胞焦亡進(jìn)行深入的研究有助于進(jìn)一步闡明相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，并為探索新的治療策略提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 細(xì)胞焦亡過程

細(xì)胞焦亡是細(xì)胞在細(xì)菌、真菌、病毒感染等條件下，以巨噬細(xì)胞為代表的一系列細(xì)胞內(nèi)的重要模式識別受體分子(即炎癥小體)-AIM2、NLRC4、NLRP1、NLRP3等開始活化，它們可直接或者間接在凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的協(xié)助下募集并活化caspase1，活化后的caspase1促使炎性因子IL-1β和IL-18前體的成熟并釋放出胞；與此同時細(xì)胞膜表面開始形成微孔[2]，膜內(nèi)外離子和水分子經(jīng)過微孔的流動形成胞內(nèi)外滲透梯度，繼而導(dǎo)致細(xì)胞脹破發(fā)生溶解性死亡，此時細(xì)胞內(nèi)具有免疫活性的ATP、人高遷移率族蛋白1(HMGB1)以及IL-1α等物質(zhì)大量釋放，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎性反應(yīng)。有趣的是，破裂的細(xì)胞也使得潛藏在胞內(nèi)的病原體重新暴露于宿主免疫環(huán)境，從而促進(jìn)了中性粒細(xì)胞等吞噬細(xì)胞對病原體的清除作用[3]。

2 細(xì)胞焦亡的識別機(jī)制

在細(xì)胞焦亡的發(fā)生過程中，炎癥小體對焦亡信號的識別作用是發(fā)生焦亡的重要起始階段。而要清晰地了解這一過程，首先要熟知固有免疫對于異己的識別機(jī)制。

傳統(tǒng)意義上來說，固有免疫系統(tǒng)是通過細(xì)胞內(nèi)外的一系列模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)來識別多種細(xì)菌、病毒、真菌以及其他類型病原體和毒素形成的病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，從而清除入侵的病原體。目前已知的模式識別受體主要由胞外型(如Toll樣受體、C型凝集素樣受體)和胞內(nèi)型NOD樣受體、熱蛋白(Pyrin)以及AIM2樣受體組成，而炎癥小體則主要是由上述胞內(nèi)的PRRs組成的復(fù)合物[4]。當(dāng)機(jī)體處于感染狀態(tài)時，胞外的病原體可直接被巨噬細(xì)胞內(nèi)吞或通過胞外PRRs識別作用入胞，此時位于胞內(nèi)的炎癥小體活化并感知識別相應(yīng)焦亡信號，觸發(fā)一系列焦亡反應(yīng)的發(fā)生。

除了上述的感染因素外，某些損傷性疾病如腦外傷患者體內(nèi)損傷細(xì)胞釋放的危險信號分子(Damage associated molecular pattern,DAMPs)同樣能被炎癥小體識別而觸發(fā)細(xì)胞焦亡[5]。

2.1 炎癥小體 目前已發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥小體主要有AIM2、NLRP1、NLRC4和NLRP3等，不同炎癥小體的構(gòu)成及所能識別的焦亡信號都有差異。

2.1.1 AIM2/IFI16 AIM2屬于ALRs(AIM2-like receptors,ALRs)家族成員，它由HIN-200結(jié)構(gòu)域和熱蛋白結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain,PYD)構(gòu)成。AIM2可以識別包括產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌、弗朗西斯菌以及巨細(xì)胞病毒在內(nèi)的多種胞內(nèi)病原體的雙鏈DNA[6]，隨后通過PYD結(jié)構(gòu)域與ASC的相互作用，募集前體caspase1，誘發(fā)焦亡和IL-18、IL-1β的成熟釋放。

人的AIM2又稱為IFI16，近來有研究發(fā)現(xiàn)IFI16能夠識別HIV逆轉(zhuǎn)錄合成的ssHIV DNA，誘導(dǎo)AIDS患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞發(fā)生焦亡，這為AIDS患者體內(nèi)CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少現(xiàn)象又提供了新的解釋[7]。有報道稱，AIM2也可以識別宿主自身的雙鏈DNA，從而提高某些自身免疫性疾病如SLE的發(fā)生風(fēng)險[8]。

2.1.2 NLRP1 NLRP1是較早發(fā)現(xiàn)的NLRs(Nod-like receptors,NLRs)家族的炎癥小體，宿主細(xì)胞內(nèi)炭疽致命毒素(LeTx)、鼠弓形蟲[9]以及胞壁酰二肽(MDP)在內(nèi)的多種菌體成分都可激活NLRP1。該炎癥小體的兩端分別由PYD結(jié)構(gòu)域和caspase招募結(jié)構(gòu)域(Caspase activation and recruitment domain，CARD)組成，中間則由富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACHT)以及對其活化十分重要的具有催化自我切割功能的FIIND結(jié)構(gòu)域組成[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，人類NLRP1有NLRP1a、b、c三種鼠系同源體，這三種鼠源性NLRP1有著很強(qiáng)的種屬多樣性，它們與人類的NLRP1有諸多不同。在LeTx的作用下，鼠源NLRP1b的某些同源變異被激活[如Mouse Nlrp1b Allele-5 (CAST)、Mouse Nlrp1b Allele-1 (BALB,129)等]，同時LeTx能夠切割NLRP1b的N端結(jié)構(gòu)，使其活化并觸發(fā)焦亡。而人的NLRP1則不會發(fā)生該變化[11]。

2.1.3 NLRP3 NLRP3同屬于NLRs家族，研究表明，此炎癥小體參與了包括HIV、自身免疫疾病在內(nèi)的多種疾病的病理生理過程，是目前研究相對較多的一類炎癥小體。目前已知，可引起胞內(nèi)NLRP3激活的途徑主要有三種：①胞外的ATP能夠促進(jìn)P2X7和pannexin1通道開放，觸發(fā)鉀離子流出的同時胞外的PAMPs經(jīng)pannexin1通道流入胞質(zhì)，直接活化NLRP3[12]。②吞噬入胞的β淀粉樣蛋白、石棉、明礬、二氧化硅等物質(zhì)會破壞吞噬溶酶體穩(wěn)定性，通過組織蛋白酶B等吞噬溶酶體內(nèi)容物的釋放活化NLRP3[13,14]。③活性氧(ROS)和線粒體功能失調(diào)也介導(dǎo)了NLRP3的活化[15]。目前已知，NLRP3的活化主要存在兩個主要過程，包括NF-κB介導(dǎo)的NLRP3、前體IL-1β的合成和NLRP3脫泛素、ASC泛素化和磷酸化等翻譯后修飾作用在內(nèi)的起始過程，以及NLRP3的精確組裝過程[16]。

2.1.4 NLRC4 NLRC4和NLRP1一樣，都含有可以直接活化caspase1的CARD結(jié)構(gòu)域。它能夠識別包括鞭毛蛋白(flagellin)、Ⅲ型分泌系統(tǒng)的針狀和桿狀蛋白(T3SS needle and rod protein)在內(nèi)的三種細(xì)菌結(jié)構(gòu)，進(jìn)而誘使宿主的免疫細(xì)胞發(fā)生焦亡。然而，面對如此多樣的細(xì)菌種類，NLRC4如何進(jìn)行特異性的識別一直困擾著學(xué)界。近來，Zhao[17]和Vance[18]證實(shí)NLRs家族的NAIP蛋白可能參與了這種特異性的識別過程。研究表明，小鼠有NAIP1-7七種同源物，而人類則只有一種hNAIP。其中NAIP1/hNAIP、NAIP2和NAIP5/6分別識別T3SS的針狀蛋白、T3SS的桿狀蛋白和鞭毛蛋白，在接受特定的刺激后，NAIP和NLRC4共組裝形成炎癥小體，募集并活化caspase1引發(fā)細(xì)胞焦亡[19]。

3 細(xì)胞焦亡相關(guān)信號通路

在細(xì)胞焦亡的研究中，學(xué)界曾認(rèn)為caspase1是唯一處于核心地位的分子。然而，Kayagaki等[20]發(fā)現(xiàn)小鼠的caspase11也能介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。自此，細(xì)胞焦亡分為了caspase1依賴的經(jīng)典型炎癥小體通路和caspase11依賴的非經(jīng)典型炎癥小體通路兩種類型。

3.1 經(jīng)典型caspase1炎癥小體通路 通過經(jīng)典型炎癥小體通路發(fā)揮作用的炎癥小體通常為AIM2、NLRP1、NLRC4以及NLRP3等。在該通路中，Caspase1的活化主要依賴于炎癥小體和ASC相互的募集作用。ASC在caspase1的活化中起著重要的中介作用，它是由一個PYD結(jié)構(gòu)域和一個CARD結(jié)構(gòu)域組成的銜接蛋白，部分炎癥小體內(nèi)也含有這兩種結(jié)構(gòu)域，它們能夠通過CARD-CARD或PYD-PYD間的相互作用吸引ASC的聚集，而ASC自身的CARD結(jié)構(gòu)域又能夠募集大量的前體caspase1，誘導(dǎo)該分子發(fā)生自我切割并活化，觸發(fā)細(xì)胞焦亡。這種途徑稱為經(jīng)典型caspase1通路。

Caspase1依賴的細(xì)胞焦亡主要在小鼠和人的巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞中發(fā)生。近來在角蛋白細(xì)胞[21]、腸上皮細(xì)胞[22]、神經(jīng)元細(xì)胞[5]中也發(fā)現(xiàn)了類似的caspase1依賴的細(xì)胞焦亡現(xiàn)象。

3.2 非經(jīng)典型caspase11炎癥小體通路 與上述通路不同，小鼠的caspase11和人的caspase4/5等可在沒有經(jīng)典型炎癥小體和ASC參與的情況下直接識別胞內(nèi)的細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)，誘發(fā)細(xì)胞焦亡[23]。

現(xiàn)已知，免疫細(xì)胞表面的Toll樣受體4識別胞外的LPS，而caspase11則識別胞內(nèi)LPS[24]。在干擾素誘導(dǎo)的鳥苷酸結(jié)合蛋白作用下，LPS從含革蘭氏陰性菌的液泡釋放入巨噬細(xì)胞胞質(zhì)，隨后LPS的脂質(zhì)A與前體caspase11的CARD結(jié)構(gòu)域可發(fā)生寡聚化作用形成復(fù)合體，即非經(jīng)典型炎癥小體[25，26]。在LPS誘導(dǎo)的caspase11活化過程中，Ⅰ型干擾素和IFN-γ起到了關(guān)鍵作用[27，28]。有趣的是，近來研究表明，caspase11的活化同時也能引起NLRP3-ASC-caspase1通路的激活[29]，這種特殊的激活途徑稱為“非典型NLRP3炎癥小體活化通路”，caspase11可以通過這種方式促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟釋放。目前，caspase11介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的具體機(jī)制仍存在很多疑問。近來，發(fā)表在Immunity雜志的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，caspase11可通過一種由ATP調(diào)控的P2X7信號通路介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，同時該文章還發(fā)現(xiàn)，該通路的激活也是小鼠發(fā)生由caspase11介導(dǎo)的內(nèi)毒素性休克的重要原因[30]。

關(guān)于上述兩種焦亡通路的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及是否還存在其他焦亡通路的問題仍有待進(jìn)一步的研究來解答。

4 細(xì)胞焦亡與凋亡

細(xì)胞焦亡作為一種細(xì)胞死亡過程，與傳統(tǒng)意義上的細(xì)胞凋亡、壞死、衰老等均不同，而這其中細(xì)胞凋亡與焦亡有著更為密切的關(guān)系。限于篇幅限制，我們這里只對細(xì)胞凋亡和焦亡的區(qū)別與聯(lián)系進(jìn)行敘述。

細(xì)胞凋亡是最先發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞程序性死亡。從形態(tài)學(xué)角度來說，發(fā)生凋亡的細(xì)胞胞膜內(nèi)陷形成包裹有細(xì)胞器和胞質(zhì)的凋亡小體從而被巨噬細(xì)胞吞噬，整個凋亡過程中胞膜完整性沒有被破壞，所以并不會引起炎性反應(yīng)。而焦亡的細(xì)胞由于胞膜微孔的形成導(dǎo)致細(xì)胞脹破死亡，胞質(zhì)內(nèi)容物釋放，會引發(fā)明顯的炎性反應(yīng)。其次，發(fā)生凋亡的細(xì)胞會出現(xiàn)胞核染色體濃縮、DNA發(fā)生片段化甚至胞核碎裂，而盡管有報道稱細(xì)胞焦亡也會出現(xiàn)輕微的DNA損傷和染色體濃縮現(xiàn)象，但此時焦亡細(xì)胞的胞核仍舊保持完整[23]。

現(xiàn)已證明，caspase家族觸發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞凋亡發(fā)生過程的中心環(huán)節(jié)。與焦亡依賴caspase1/11不同，凋亡相關(guān)半胱天冬酶主要包括caspase3/6/7/8/9/10，其中屬于凋亡起始的caspase8/9/10作為受體應(yīng)答內(nèi)源或外源性凋亡信號，引起凋亡效應(yīng)的caspase3/6/7自身剪切活化，隨后這些效應(yīng)caspase進(jìn)一步剪切下游靶蛋白觸發(fā)凋亡[3，31]。

盡管在細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征、信號通路等方面有著諸多不同，細(xì)胞焦亡和凋亡的某些作用通路也存在一定的聯(lián)系。近來有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡中的炎癥小體AIM2和NLRP3也可以通過ASC的PYD結(jié)構(gòu)域與caspase8的死亡結(jié)構(gòu)域(Death effector domain，DED)相互作用募集caspase8，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程的發(fā)生[32,33]。對于細(xì)胞而言，焦亡和凋亡均可能發(fā)生，有人認(rèn)為決定不同死亡結(jié)局出現(xiàn)的主要因素可能與細(xì)胞接受的刺激信號強(qiáng)弱相關(guān)，較強(qiáng)的刺激信號能夠引起細(xì)胞焦亡，而較弱的刺激信號則可能引起細(xì)胞凋亡[32]。

5 細(xì)胞焦亡與臨床疾病

盡管炎癥小體及細(xì)胞焦亡過程在抵御病原體侵襲方面有著重要作用，但有時異常的細(xì)胞焦亡過程也會帶來消極影響。

編碼炎癥小體的基因發(fā)生突變可能是多種自身免疫性疾病發(fā)生的重要原因。隱熱蛋白相關(guān)周期綜合征(Cryptothermal protein-associated cycle syndrome,CAPS)是以家族性寒冷自身炎癥綜合征、蕁麻疹-耳聾-淀粉樣變性綜合征以及新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病為主要表現(xiàn)的一組臨床綜合征，多項研究發(fā)現(xiàn)該病的發(fā)生與體內(nèi)IL-1β的異常升高有關(guān)，而這一病理生理過程與NLRP3的活化有很強(qiáng)的相關(guān)性。近來有團(tuán)隊證實(shí)，NLRP3的Ser295位點(diǎn)突變能夠顯著降低體內(nèi)前列腺素E2對該炎癥小體活化的抑制作用，從而間接促進(jìn)CAPS疾病的進(jìn)展[34]。還有研究表明，炎癥小體NLRC4內(nèi)高度保守序列NBD的新生錯義突變與巨噬細(xì)胞活化綜合征的發(fā)生有關(guān)[35]，而編碼NLRP1基因的某些單核苷酸多態(tài)性如M1184V等可能通過促進(jìn)自身FIIND結(jié)構(gòu)域的切割活化過程而增加了健康人罹患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白癜風(fēng)、克羅恩病等疾病的風(fēng)險[10]。

炎癥小體介導(dǎo)的神經(jīng)元炎性反應(yīng)同樣也是很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生的機(jī)制。阿茲海默癥(Alzheimer disease,AD)是嚴(yán)重影響人類認(rèn)知功能的一種神經(jīng)退行性改變，腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的沉積被認(rèn)為是AD的特征性表現(xiàn)。正是由于該蛋白的增多，誘發(fā)了神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)的慢性炎癥以及小膠質(zhì)細(xì)胞免疫功能的破壞，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的退行性改變并發(fā)腦功能紊亂。Heneka等[36]認(rèn)為，β-淀粉樣蛋白能夠通過溶酶體的組織蛋白酶B激活NLRP3，從而加重神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，一定程度上促進(jìn)了AD的疾病進(jìn)展。未來針對炎癥小體的靶向治療也許能在某種程度上延緩阿茲海默癥的惡化。此外，NLRP3介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥和免疫異常也是帕金森綜合征發(fā)生的重要機(jī)制，近來Yan等[37]研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)多巴胺可以通過cAMP抑制NLRP3的活化從而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)水平，而帕金森患者體內(nèi)由于缺乏多巴胺將會進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的激化，加重病情。

細(xì)胞焦亡也與一些代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。眾所周知，Ⅱ型糖尿病患者體內(nèi)的胰腺β細(xì)胞功能和數(shù)量都處于較低水平，有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3介導(dǎo)的IL-1β異常升高是導(dǎo)致糖尿病胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞功能損害和數(shù)量減少的重要因素，而另一方面，NLRP3的異?；罨軌虼蠓鰪?qiáng)糖尿病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，使患者發(fā)生心腦血管事件的風(fēng)險大大提高[38]。此外，研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化的關(guān)鍵分子——膽固醇結(jié)晶對NLRP3的活化作用可能參與了血管壁慢性炎癥過程[39]。

IL-18以及IL-1β在細(xì)胞焦亡的致病過程中有著重要作用，目前針對IL-1受體的拮抗劑阿那白滯素(anakinra)、利納西普(rilonacept)以及IL-1β的拮抗劑卡那奴單抗(canakinumab)在治療CAPS等很多疾病時都顯現(xiàn)出了一定療效[40]。然而，炎癥小體和caspase1的異常活化也許才是疾病發(fā)生的根本原因，我們期待更多可直接阻斷焦亡重要通路的藥物能獲得更好的臨床療效。近來有研究發(fā)現(xiàn)，β-羥丁酸能阻止鉀離子外流并影響ASC功能，從而抑制NLRP3的活化[41]，或許是未來治療NLRP3異?；罨嚓P(guān)的疾病潛在的治療靶點(diǎn)。

6 總結(jié)與展望

關(guān)于細(xì)胞焦亡具體機(jī)制的探討一直是研究的熱點(diǎn)。近來邵峰團(tuán)隊取得了突破性進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞焦亡關(guān)鍵的下游分子——gasdermin-D(GSDMD)。caspase1/11切割該分子產(chǎn)生的N端結(jié)構(gòu)是細(xì)胞焦亡過程中細(xì)胞膜上微孔形成的關(guān)鍵物質(zhì)[42]。這一機(jī)制的揭示，為細(xì)胞焦亡理論的發(fā)展提供了新的啟示，未來針對細(xì)胞焦亡的研究應(yīng)更側(cè)重對該通路的關(guān)鍵靶位如炎癥小體、caspase1/11、ASC的相關(guān)信號通路及轉(zhuǎn)錄機(jī)制的深入探索，此外，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生的直接原因——包膜上微孔的形成機(jī)制也有著很高的研究價值。

本文就細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子機(jī)制、信號通路及其在臨床疾病發(fā)病機(jī)制的重要作用進(jìn)行了詳細(xì)的闡述和探討，盡管還有諸多的疑問有待解答，但筆者相信隨著細(xì)胞焦亡相關(guān)機(jī)制研究的深入，將有助于幫助臨床更好應(yīng)對相關(guān)的疾病。